青霉素遇酸易分解，口服吸收差，肌注100萬單位后吸收快且甚完全，0.5小時達血藥濃度峰值，約為20U/ml，消除半衰期（t1/2）為1/2小時。6小時內靜滴500萬單位青霉素鈉，2小時后能獲得20～30U/ml的血藥濃度。青霉素的血清蛋白結合率為46%～58%。青霉素主要分布于細胞外液，淋巴液、胎盤、肝、腎、肺、橫紋肌、中耳液等。青霉素的脂溶性低，進入細胞量減少；房水與腦脊液中含量也較低，但炎癥時青霉素透入腦脊液和眼的量可略提高，能達有效濃度。青霉素幾乎全部以原形迅速經尿排泄，約10%經腎小球過濾。90%經腎小管分泌。無尿患者青霉素的消除半衰期可延長達10小時。丙磺舒可與青霉素競爭腎小管分泌，兩藥合用時能提高青霉素的血藥濃度，延長其半衰期。
為了延長青霉素的作用時間，還可采用難溶制劑普魯卡因青霉素（procacaine
penicillin）和芐星青霉素（benzathine penicillin；長效西林，bicillin）。它們的水懸劑或油制劑肌內注射后，在注射部位緩慢溶解吸收。普魯卡因青霉素一次注射40萬單位，可維持24小時，芐星青霉素溶解度極小，一次注射120萬單位，可維持15天，這兩種制劑的血藥濃度很低，只用于輕癥病人或用于預防感染。