實驗方法原理
本實驗以含原λ噬菌體和缺陷噬菌體λdg的雙重溶原菌gal+作為供體,經紫外線誘導后,獲取能轉導半乳糖發酵基因的高頻轉導噬菌體裂解液,然后讓這些轉導噬菌體將gal+基因轉移到受體菌gal-中去。
實驗材料 供體菌 : Escherichia coli K12 F2 gal + (帶有原噬菌體λ和缺陷噬菌體λdg)受體菌 : E . coli K12 S gal -
試劑、試劑盒 LB液2×LB液YT液體培養基YT半固體培養基YT固體培養基9皿EMB-gal培養基11皿pH7.0的磷酸緩沖液生理鹽水氯仿
儀器、耗材 臺式離心機 恒溫水浴鍋 小試管 大試管 移液管 培養皿 紫外輻射裝置
實驗步驟
(一)噬菌體裂解液的制備
1.將供體菌接入5mlLB培養液中,37℃振蕩培養過夜。
2.取0.5ml過夜培養物轉入另一支5mlLB培養液試管中(剩余的菌液置冰箱保存,備用),37℃繼續培養4～6h。
3.將培養物轉入10ml無菌離心管中,4℃3000r/min離心10min。
4.去上清液,加1ml的磷酸緩沖液(0.1mol/L,pH7.0),振蕩懸浮,再加入4ml同樣的緩沖液制成菌懸液。
5.取2ml菌懸液于無菌培養皿(Φ6cm)中。在紅光下將含有菌懸液的培養皿置紫外燈(15W)40cm處,打開培養皿蓋照射10s(邊照射邊攪拌),然后加入2×LB液2ml,混勻后置37℃避光培養2～3h。
6.將上述暗培養液轉入無菌大試管中,加入5～8滴氯仿,劇烈振蕩30s,室溫靜置5min后轉入另一支無菌離心管,再經4℃,3000r/min離心10min。
7.小心將上清液吸取轉入另一無菌試管中,上清液即為λ噬菌體裂解液。裂解液中加入一滴氯仿,混勻后置4℃保存,備用。
(二)噬菌體效價的測定
1.將受體菌接入5ml培養液(補加麥芽糖和MgSO4),置37℃振蕩培養過夜。
2.取0.5ml過夜培養物于另一支5mlYT培養液(同樣加麥芽糖和MgSO4)試管中(其余的受體菌液置4℃保存,備用),37℃繼續振蕩培養3～4h。
3.將噬菌體裂解液用YT培養液稀釋至10-7,分別取10-5、10-6、10-7稀釋液0.1ml于無菌試管中,再加入0.1ml受體菌液,混勻后置37℃保溫15～20min,然后倒入4.5ml半固體YT培養基(培養基溫度約為45℃),混勻后,迅速倒入底層YT培養基的平板中。按此操作每稀釋度制3皿,待凝固后置37℃培養過夜。
4.觀察出現的噬菌斑,計算裂解液中噬菌體的效價。
(三)轉導試驗
1. 取EMB-gal平板二皿,在平板底部按圖27-1畫上標記。
2. 取保存的受體菌液少許涂成一條帶,再取保存的供體菌液少許在另一區域涂一條帶。待干后在兩個圓圈和兩個方格內各滴一小滴噬菌體裂解液(先滴兩圓圈內,后滴方格內),置37℃培養48h。
3. 觀察平板上形成的噬菌體,統計噬菌斑形成單位數(PFUs),并計算λ噬菌體裂解液的效價。
4. 圖示轉導試驗結果,確定是否出現轉導現象。
注意事項
1.配制半固體培養基時,使用瓊脂粉為宜。瓊脂的濃度為0.45%～0.5%。
2.噬菌體裂解液與受體菌液混合保溫期間切勿搖動試管,以免影響噬菌體的吸附,使其效價偏低。
其他
實驗試劑：
LB 液 ( 5ml/ 試 管 2 支 ; 4. 5ml/ 100ml 三角 瓶 1 瓶 ) , 2× LB 液 ( 2ml/ 小 試 管 1 支 ) ,YT 液體培養基 ( 4. 5ml/ 試管 1 支 ; 4. 5ml/ 試管 7 支 ; 4 .5ml/ 100ml 三角瓶 1 瓶 ) , YT 半固體培養基 (4 .5ml/ 試管 9 支) , YT 固體培養基 9 皿 ( 本實驗中 YT 培養基均補加麥芽糖和 MgSO4 , 終濃度分別為 1 % 和 10mmol/ L) , EMB-gal 培養基 11 皿 , 0 .1mol/ L pH7. 0 的磷酸緩沖液 ( 4ml/ 試管 1 支 ) , 生理鹽水 (4 .5ml/ 試管 3 支 ) , 氯仿。