當 λ 噬菌體臂與外源基因組 DNA 片段相連時，必須考慮到兩個參數：噬菌體臂與潛在插入片段的摩爾比，以及在反應混合物中各類 DNA 的濃度。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 當 λ 噬菌體臂與外源基因組 DNA 片段相連時，必須考慮到兩個參數：噬菌體臂與潛在插入片段的摩爾比，以及在反應混合物中各類 DNA 的濃度。 |
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| 實驗材料 | 噬菌體 T4 DNA 連接酶基因組 DNAλ 噬菌體包裝混合物λ 噬菌體臂 DNA |
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| 試劑、試劑盒 | ATPSM 和 SM+ 明膠 |
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| 儀器、耗材 | 瓊脂糖凝膠LB 或 NZCYM 瓊脂平板水浴 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
ATP ( 10 mmol/L)
SM 和 SM+ 明膠
2. 酶和緩沖液
噬菌體 T4 DNA 連接酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠（0.7%）, 用 0.5X TBE, 含 0.5 μg/ml 溴化乙錠
4. 核酸和寡核苷酸
適當大小的基因組 DNA，用于載體克隆
5. 培養基
LB 或 NZCYM 瓊脂平板
LB 或 NZCYM 頂層瓊脂糖
6. 專用設備
預置于 47℃ 的加熱儀或水浴（用于頂層瓊脂糖)
預置于 16℃ 的水浴
7. 載體和菌株
λ 噬菌體包裝混合物
λ 噬菌體臂 DNA
二、方法
1. 建立含有如下物質的一系列連接反應：
λ 噬菌體臂 0.5~1.0 μg，部分酶切基因組 DNA 6~1200 ng，10X 連接緩沖液 0.5~1.0 μl，10 mmol/L ATP（若必需） 0.5~1.0 μl，噬菌體 T4 DNA 連接酶 0.5~1.0 μl，水 至 5 或 10 μl。
建立兩個對照反應，其中載體和插入 DNA 任缺其一。將連接反應置 16℃ 溫育 4~16 h。
為了獲得最大的連接效率，建立體積盡可能小的反應體系（5~10 μl）。若 ATP 作為 10X 連接緩沖液的一種組分加入反應混合物中，則將給載體或外源 DNA 留出更大的體積。
如果應用含 ATP 的商品化連接緩沖液，則省略 ATP。
2. 在各連接反應中取 10%~25% 的組分，按照生產商提供的關于包裝提取物的說明包裝入噬菌體顆粒。
大多數的生產商都提供入噬菌體 DNA 對照，作為檢測包裝效率的標準。
3. 將包裝反應進行 10 倍系列稀釋（10-1~10-5），用 SM+ 明膠或廠家推薦的相應緩沖液作為稀釋液。
4. 分析每個稀釋度 1 μl 和 10 μl 所形成噬菌斑的數量。
5. 從得到感染性噬菌體顆粒最多的連接反應中，挑取 6~12 個噬菌斑，從每個噬菌斑制備小量重組 DNA。
6. 用適當的限制酶消化，隨后進行 0.7% 的瓊脂糖凝膠電泳，并使用適宜的分子質量標準，檢測所插入基因組 DNA 的大小。
7. 如果噬菌體是重組子且含有合適大小的插入片段，則通過建立多個連接和包裝反應構建基因組 DNA 文庫。在這些反應中插入片段和載體 DNA 的比值應是，在試反應中產生最多重組噬菌斑所采用的比值。
8. 估算大規模連接和包裝反應所產生的所有重組噬菌斑的量，并計算如此大小的文庫所能覆蓋整個目標基因組的程度。
為了對某一哺乳動物基因組（3X109 bp ) 提供一個 5 倍的覆蓋率，則一個平均含有 20 kb 插入片段的 λ 噬菌體文庫需包含 2X106 個獨立的重組子。 |
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