實驗方法原理 噬菌斑起源于單個噬菌體顆粒對單個細菌的感染。第一次感染后合成的子代病毒顆粒吸附和感染鄰近細菌，后者依次釋放另一代子代病毒顆粒。如果細菌生長在半固體培養基（如含瓊脂糖或瓊脂）上，這種子代病毒顆粒的擴散是有限的。
實驗材料 λ 噬菌體原種大腸桿菌菌株
試劑、試劑盒 MgSO4SM 和 SM+ 明膠
儀器、耗材 LB 或 NZCYM 瓊脂平板Sorvall SS-34 或相當型號圓形濾紙水浴
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
MgSO4 (10 mmol/L)，SM 和 SM+ 明膠
2. 培養基
LB 或 NZCYM（50 ml 分裝于 250 ml 的圓錐瓶中）
LB 或 NZCYM 瓊脂平板
LB 或 NZCYM 頂層瓊脂或瓊脂糖（0.7%）
3. 離心機和轉子
Sorvall SS-34 或相當型號。
4. 專用設備
圓形濾紙（適用于培養皿）
加熱設備或預置于 47℃ 的水浴
5. 載體和菌株
λ 噬菌體原種
大腸桿菌菌株
二、方法
鋪平板細菌的制備
1. 接種適宜的大腸桿菌菌株的單菌落于 NZCYM 或 LB 培養基（50 ml 分裝于 250 ml 錐形瓶）中，37℃ 中度振蕩培養過夜。
一些方案推薦用 30℃ 培養而不是 37℃。低溫生長將增加過夜培養細胞不能達到飽和狀態的機會，這樣減少了培養基中細胞碎片的量。正如早先提到的，噬菌體加入至飽和培養物中，會吸附到細胞碎片中的 LamB 蛋白上，因而減少了噬菌體培養物的滴度。
2. 室溫，4000 g（或 5800 r/min 于 Sorvall SS-34 轉子中）離心 10 min，收集細胞。
3. 去上清，用 20 ml 10 mmol/L MgSO4 重新懸浮沉淀。測量 100 倍稀釋后的 OD600 值，并進一步用 10 mmol/L MgSO4 將細胞懸浮液稀釋至終濃度為 OD600 等于 2.0。
為了提高貯存過程中鋪平板細菌的存活率，將細胞懸浮液置于 100 ml 的無菌燒瓶 37℃ 中度振蕩培養 1 h。
4. 平板培養物的菌懸液于 4℃ 保存。
健壯的大腸桿菌菌液在 2~3 周后仍可用。但是，嚴重衰弱的大腸桿菌（如 recA- 菌株）在饑餓條件下于 4℃ 將快速失去存活能力。當用這類菌株進行 λ 噬菌體培養時需要新鮮的培養物。
5. 用微波爐進行短時間加熱以熔化上層瓊脂或瓊脂糖。將熔化的瓊脂或瓊脂糖分裝 ( 100 mm 的平皿 3 ml，200 mm 的平皿 7 ml )后，置于加熱容器內或 47℃ 水浴中，以便使溶液保持熔化狀態。
鋪平板細菌的感染
6. 將噬菌體原種進行 10 倍系列稀釋（于 SM+ 明膠中 )，用輕微渦旋振蕩或輕拍試管一側使各稀釋度徹底混勻。
7. 從步驟 4 的鋪平板細菌中取 0.1 ml 至一系列無菌試管中（13 或 17 X 100 mm）。
8. 在裝有鋪平板細菌的每個試管中依次加入 0.1 ml 各稀釋度的噬菌體，經搖晃或輕微渦旋振蕩混勻細菌和噬菌體。
9. 將混合物置 37℃ 溫育 20 min，使噬菌體顆粒吸附到細菌上。將試管從水浴鍋中挪出，使其冷卻至室溫。
10. 將一個分裝管中的已熔瓊脂或瓊脂糖加入第一個試管中，用輕拍或渦旋振蕩 5 s 進行混勻，立即將試管內的所有物質傾倒于一個標記好的瓊脂平板的中央。要盡量避免產生氣泡。輕輕地旋轉平板使細菌和上層瓊脂糖均勻地分布。重復這個操作，直到所有的試管中的物質都轉移至分別標記好的平板中。
11. 將平板蓋上蓋，在室溫放置 5 min，使上層的瓊脂或瓊脂糖凝固，最后將平板倒置于 37℃ 培養。
對一些大腸桿菌和噬菌體載體來說，平板于室溫培養而非 37℃ 將形成更好的噬菌斑。比如，當用 Stretagene 公司的 SRBρ 和 SRB(P2)ρ 作宿主菌時，推薦使用 39℃ 作為溫育溫度。另外，當 λgt10 于 39℃ 培養時，將在大腸桿菌 hfl- 株中產生更好的噬菌斑。
12. 繼續培養過夜，然后計算或篩選（挑取）單獨的噬菌斑。
大約培養 7 h 后出現噬菌斑，12~16 h 后進行記數或挑取噬菌斑。此時，在健壯大腸桿菌中形成的噬菌斑的直徑約為 2~3 mm。如果平板太干，噬菌斑將生長緩慢且不能達到其最大直徑。新鮮制備的平板有不同的問題。在 37℃ 培養過程中，水蒸氣會在頂層瓊脂上形成水珠，使生長的噬菌斑因水珠的流動而相互污染。為了避免這一問題，用前可將平板在室溫放置 2 d，或者半敞開蓋子在層流柜或 37℃ 培養箱（效果稍差一點）中放置 2 h。如果急用，沒有時間干燥平板，則等頂層瓊脂凝固后除去平皿蓋上的水珠，并在每個蓋內加入一張圓形無菌濾紙。在 37℃ 倒置培養過程中，濾紙將吸收水蒸氣，最大限度地減少噬菌斑的交叉污染。
有經驗的話，噬菌斑可調整至合適的大小。比如，當用雜交篩選文庫時，常希望限制噬菌斑的大小以便在每個平板中篩選到最大數量的噬菌體。從這個角度考慮，應該用時間比較久的平板，并加入比通常略多一些的細菌作菌苔。在其他條件下，如當使用衰弱的 red- gam- λ 噬菌體時，必須減少細菌的接種量和（或）用低濃度（0.6 %）的頂層瓊脂或瓊脂糖來獲得適宜大小的噬菌斑。當菌苔長滿而細胞達到穩定期后，λ 噬菌斑將不再增大。
