Ⅱ級生物安全柜又稱為層流生物安全柜。與工級生物安全柜不同之處是進入的空氣先經HEPA過濾，保證覆蓋臺面上的空氣是無菌的，不僅提供個人防護，也保護樣品不受污染。Ⅱ級生物安全柜共分Ⅱ級A和Ⅱ級B型2種，又可進一步再分為Ⅱ級A 1、Ⅱ級A 2、Ⅱ級B 1、Ⅱ級B2型。Ⅱ級生物安全是自遏型的。流動空氣中的70％可以反復循環再利用。此種生物安全柜適合于細胞或組織培養、接觸2～3級危險等級病原體的操作，如果穿正壓防護服可在Ⅱ級生物安全柜上從事接觸4級危險等級感染因子的操作。
