一文讀懂分子診斷常用技術（一）

分子診斷技術是指以DNA和RNA為診斷材料，用分子生物學技術通過檢測基因的存在、缺陷或表達異常，從而對人體狀態和疾病作出診斷的技術。其基本原理是檢測DNA或RNA的結構是否變化、量的多少及表達功能是否異常，以確定受檢者有無基因水平的異常變化，對疾病的預防、預測、診斷、治療和預后具有重要意義。通俗簡單的講所有基于分子生物學水平的方法學技術都屬于分子診斷技術，比如PCR技術、基因測序技術等等。

PCR技術即聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，基本原理類似于DNA的天然復制過程，由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性，模板DNA與引物的退火(復性)，引物的延伸。重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。簡單講PCR技術本質上是針對DNA片段進行擴增放大，通過實時熒光PCR技術使得樣本中DNA含量可以檢測出來。

基因測序技術即測定DNA序列的技術。在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和 Maxam和 Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產生 A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前 Sanger測序法得到了廣泛的應用。簡單講基因測序技術是針對DNA片段進行測序和分析，使得DNA序列得以清晰。

上世紀60年代至80年代是分子雜交技術發展最為迅猛的20年,由于當時尚無法對樣本中靶基因進行人為擴增,人們只能通過已知基因序列的探針對靶序列進行捕獲檢測。其中液相和固相雜交基礎理論、探針固定包被技術與cDNA探針人工合成的出現,為基于分子雜交的體外診斷方法進行了最初的技術儲備。

(一)DNA印跡技術(Southern blot)

Southern[1]于1975年發明了DNA印跡技術,通過限制性內切酶將DNA片段化,再以凝膠電泳將長度不等的DNA片段進行分離,通過虹吸或電壓轉印至醋酸纖維膜上,再使膜上的DNA變性與核素標記的寡核苷酸探針進行分子雜交,經洗脫后以放射自顯影鑒別待測的DNA片段-探針間的同源序列。這一方法由于同時具備DNA片段酶切與分子探針雜交,保證了檢測的特異性。因此,一經推出后便成為探針雜交領域最為經典的分子檢測方法,廣為運用于各種基因突變,如缺失、插入、易位等,及與限制性酶切片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鑒定中。Alwine等[2]于1977年推出基于轉印雜交的Northern blot技術也同樣成為當時檢測RNA的金標準。

(二)ASO反向斑點雜交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)

使用核酸印跡技術進行核酸序列的雜交檢測具有極高的特異性,但存在操作極為繁瑣,檢測時間長的缺點。1980年建立的樣本斑點點樣固定技術則擺脫了傳統DNA印跡需要通過凝膠分離技術進行樣本固定的缺點。通過在質粒載體導入單堿基突變的方法,構建了首條等位基因特異性寡核苷酸探針(allele-specific oligonucleotide,ASO),更使對核酸序列點突變的檢測成為可能。1986年,Saiki[3]首次將PCR的高靈敏度與ASO斑點雜交的高特異性結合起來,實現了利用ASO探針對特定基因多態性進行分型。其后為了完成對同一樣本的多個分子標記進行高通量檢測,Saiki[4]又發明了ASO-RDB,通過將生物素標記的特異性PCR擴增產物與固定于膜上的探針雜交顯色,進行基因分型、基因突變的檢測。該法可將多種寡核苷酸探針固定于同一膜條上,只需通過1次雜交反應,即可篩查待檢樣本DNA的數十乃至數百種等位基因,具有操作簡單、快速的特點,一度成為基因突變檢測、基因分型與病原體篩選最為常用的技術。

(三)熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)

FISH源于以核素標記的原位雜交技術,1977年Rudkin[5]首次使用熒光素標記探針完成了原位雜交的嘗試。在上世紀8090年代,細胞遺傳學和非同位素標記技術的發展將FISH推向臨床診斷的實踐應用。相比于其它僅針對核酸序列進行檢測的分子診斷技術,FISH結合了探針的高度特異性與組織學定位的優勢,可檢測定位完整細胞或經分離的染色體中特定的正常或異常DNA序列;由于使用高能量熒光素標記的DNA探針,可實現多種熒光素標記同時檢測數個靶點。

如今,FISH已在染色體核型分析,基因擴增、 基因重排、病原微生物鑒定等多方面中得到廣泛應用。通過比較基因組雜交(comparative genomic hybridization,CGH)與光譜核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技術,使其正在越來越多的臨床診斷領域中發揮作用。

(四)多重連接探針擴增技術(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)

MLPA技術于2002年由Schouten等[6]首先報道。每個MLPA探針包括2個熒光標記的寡核苷酸片段,1個由化學合成,1個由M13噬菌體衍生法制備;每個探針都包括1段引物序列和1段特異性序列。在MLPA反應中,2個寡核苷酸片段都與靶序列進行雜交,再使用連接酶連接2部分探針。連接反應高度特異,只有當2個探針與靶序列完全雜交,連接酶才能將2段探針連接成1條完整的核酸單鏈;反之,如果靶序列與探針序列不完全互補,即使只有1個堿基的差別,就會導至雜交不完全,使連接反應無法進行。連接反應完成后,用1對熒光標記的通用引物擴增連接好的探針,每個探針擴增產物的長度都是唯一的。最后,通過毛細管電泳分離擴增產物,便可對把核酸序列進行檢測。由于巧妙地借鑒了擴增探針的原理,MLPA技術最多可在1次反應中對45個靶序列的拷貝數進行鑒定。

該技術具備探針連接反應的特異性與多重擴增探針雜交的高通量特性。經過MRC-Holland公司10余年的發展,MLPA技術已成為涵蓋各種遺傳性疾病診斷、藥物基因學多遺傳位點鑒定、腫瘤相關基因突變譜篩查、DNA甲基化程度定量等綜合分子診斷體系,是目前臨床最為常用的高通量對已知序列變異、基因拷貝數變異進行檢測的方法。

(五)生物芯片

1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研發的光蝕刻技術制備了首個以玻片為載體的微陣列,標志著生物芯片正式成為可實際應用的分子生物學技術。時至今日,芯片技術已經得到了長足的發展,如果按結構對其進行分類,基本可分為基于微陣列(microarray)的雜交芯片與基于微流控(microfluidic)的反應芯片2種。

1.微陣列芯片

(1)固相芯片:微陣列基因組DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯片:將微陣列技術應用于MGDP檢測中已有超過十年的歷史,其技術平臺主要分為2類,即微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型雜交陣列(SNP array)。顧名思義,aCGH芯片使用待測DNA與參比DNA的雙色比對來顯示兩者間的拷貝數變異(CNV)的變化,而單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片則無需與參比DNA進行比較,直接通過雜交信號強度顯示待測DNA中的SNP信息。隨著技術的不斷進步,目前市場上已出現可同時檢測SNP與CNV的高分辨率混合基因陣列芯片。MGDP芯片主要應用于發育遲緩、先天性異常畸形等兒童遺傳病的輔助診斷及產前篩查。經驗證,使用MGDP芯片進行染色體不平衡檢測與FISH的診斷符合率可達100%[8],表達譜芯片(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]首次使用cDNA芯片繪制了mRNA表達譜信息。隨著表觀遺傳學在疾病發生發展中的作用日益得到重視,目前也已出現microRNA芯片、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片等。類似于MGDP芯片,GEP芯片使用反轉錄后生成的cDNA文庫與固定于芯片載體上的核酸探針進行雜交,從而檢測雜交熒光信號的強度判斷基因的表達情況。相較于基因組雜交,GEP芯片對生物學意義更為重要的轉錄組信息進行檢測,對疾病的診斷與預后判斷具有特殊的意義。目前使用GEP芯片對急性髓細胞白血病、骨髓增生異常綜合征等血液病及神經退行性變等進行診斷、分類及預后評估已經獲得了令人滿意的效果;

(2)液相芯片:傳統固相芯片將檢測探針錨定于固相載體上捕獲目的序列,而Luminex公司的xMAP技術[10]則通過搭配不同比例的2種紅色熒光染料,將聚苯乙烯微球標記為不同的熒光色,并對其進行編碼得到具有上百種熒光編號的微球。通過xTAG技術將不同的特異性雜交探針交聯至編碼微球上,使得不同的探針能夠通過微球編碼得以區分。利用混合后的探針-微球復合物與待測樣本進行雜交,使微球在流動鞘液的帶動下通過紅綠雙色流式細胞儀,其中紅色激光檢測微球編碼,綠色熒光檢測經雜交后核酸探針上熒光報告基團的信號強度,一次完成對單個樣本中多種靶序列的同時鑒定。目前,該技術已在囊性纖維化等遺傳性疾病診斷、多種呼吸道病毒鑒定及人乳頭瘤病毒分型取得了廣泛的應用。

2.微流控芯片

1992年Harrison等[11]首次提出了將毛細管電泳與進樣設備整合到固相玻璃載體上構建“微全分析系統”的構想,通過分析設備的微型化與集成化,完成傳統分析實驗室向芯片上實驗室(lab-on-chip)的轉變。微流控芯片(microfluidic chip)由微米級流體的管道、反應器等元件構成,與宏觀尺寸的分析裝置相比,其結構極大地增加了流體環境的面積/體積比,以最大限度利用液體與物體表面有關的包括層流效應、毛細效應、快速熱傳導和擴散效應在內的特殊性能,從而在1張芯片上完成樣品進樣、預處理、分子生物學反應、檢測等系列實驗過程。

目前使用微流控芯片進行指導用藥的多基因位點平行檢測是主要臨床應用領域。