一次封城時期的新冠毒株測序紀實

　　1月26日，湖北省疾控中心成功從一名武漢市本地肺炎患者的肺泡灌洗液樣本中分離獲得一毒株；隨即利用Illumina測序技術展開對毒株全基因組序列測定工作，文庫制備、上機測序與數據比對分析一氣呵成。這一系列工作為湖北省新冠疫情防控、病毒變異監測奠定了堅實基礎。隨著更多毒株分離與測序，將為揭示病毒傳播途徑與追溯源頭提供重要的科學依據。那么在這個毒株測序背后發生了什么呢？

　　 1月10日

　　湖北省疾控中心生物安全三級實驗室獲國家衛健委批復，著手開展新冠病毒分離工作。

　　 1月20日

　　得知省疾控測序儀尚未就位，疫情危急，深知病毒基因組數據對于疫情防控的重要意義。Illumina迅速調配一臺iSeq樣機，由北京發往武漢，支援測序。

圖1：Illumina iSeq樣機

　　同時，來自Illumina技術支持團隊兩位資深應用專家（FAS）、市場部專家以及與友商微未來成員共同組建成一個由7人組成的 “湖北CDCnCoV測序支持小分隊”，全力協助中心毒株測序工作。

　　 1月21日

　　根據病毒分離進展情況，“小分隊”會商決定采取TruSeq Stranded Total RNA聯用Nextera XT的建庫方案。兩位FAS開始著手組織技術手冊和參考資料，為毒株測序重新制定了一套建庫方案，對關鍵步驟進行優化。

圖2：本次毒株測序建庫方案

　　 1月26日

　　毒株分離成功。病毒培養物的Real-Time RT-PCR檢測結果Ct值為10，提示樣品中病毒基因組拷貝數極高，符合建庫要求。

　　 1月27日

　　省疾控老師從繁重檢測任務中抽身，全身心投入基因組測序實驗；在FAS協助下開始實驗前準備，對測序儀及實驗相關用品做逐一清點、校驗，順利點亮iSeq。一切就緒。

圖3：測序前準備就緒

　　 1月28日

　　上午9時

　　建庫正式開始，經核酸提取、反轉錄與接頭連接、文庫純化一系列操作，核酸定量結果表明最終文庫產物濃度屬于正常范圍，提示建庫成功。

　　省疾控老師從Genebank直接下載2019-nCoV全基因組序列（MN908947.3）作為參比基因組直接導入iSeq，并通過Local Run Manager設置了本地重測序（Resequencing）分析程序。

　　晚22時

　　測序反應順利啟動。當測序試劑盒緩緩收入儀器內的一瞬間，整個”小分隊”心情既激動又緊張。

圖4：新冠分離株全基因組測序覆蓋度

出自iSeq預裝local run manager測序報告

　　 1月29日

　　 下午16時

　　順利下機。PE150條件下，產出PF Reads 6M，Q30質量數據占93%。Local run manager自動啟動參考基因組比對分析程序。16:45分，老師反饋測序結果，病毒分離株基因組全長29,847nt，平均覆蓋度4,805；經與CLC Genomics Workbench、微未來nCoV基因組測序分析軟件平行驗證，比對結果完全一致。至此，毒株基因組測序實驗順利完成。

圖5：Illumina冠狀病毒測序全流程解決方案

（病毒示意圖與親緣進化關系圖來自網絡）

　　事后幾位主要當事人如是說

　　省疾控老師：Illumina公司提供的建庫和測序流程科學又清晰，指導專業又及時；iSeq簡單易用。最重要的是，序列測定和結果分析能在儀器上一步完成。我們首例新型冠狀病毒的序列測定非常成功，感謝你們的大力支持！

　　FAS吳老師: 這次微信支持的感受還挺不錯，讓客戶能快速上手一次性順利完成實驗，說明我們的試劑盒表現是很穩定的，同時，增強客戶老師測序實驗信心和提高了參與積極性，個人覺得客戶的體驗應該也不錯。算是對建庫技術支持和培訓方式的一種新嘗試。

　　FAS楊老師：根據Qubit濃度測定結果判斷，文庫終產量介于3~10ng/μl之間，是正常文庫產量。如果超出這個區間，很可能是接頭沒有去除干凈；低于此范圍提示接頭連接效率問題。根據建庫實際情況，純化磁珠用量按比例調整到0.8（說明書標準用量參考值是0.6），這樣優化調整為了保證接頭去除更干凈，同時盡可能減少文庫損失。