提 要:
目的 建立一種快速鑒定RNA 完整性的方法。方法 在常規瓊脂糖凝膠電泳的基礎上,結合甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳加以改進而成。
結果 提取的總RNA 用此方法電泳后可得到28S、18S、5. 8S(5S) 三條清晰的rRNA 條帶。
結論 此方法可以達到對RNA 完整性進行快速鑒定的目的。
隨著分子生物學技術的迅猛發展及在醫學領域中的普及,以RNA 為研究對象的實驗與日俱增。RNA 質量的好壞直接關系到后續實驗的成敗。Northern 印跡雜交分析、寡聚(Oligdt) 纖維素選擇分離mRNA、cDNA合成及體外翻譯等實驗的成敗,在很大程度上取決于RNA 的質量。因此在進行這些實驗之前對RNA 的質量進行快速可靠的鑒定就十分必要。目前RNA 的質量采用變性瓊脂糖凝膠電泳方法來鑒定[1 ] ,這些方法步驟繁瑣、費時、費力。我室在長期進行RNA 的研究中,摸索出了一套穩定、快速和可靠的鑒定RNA 質量的方法,現報道如下。
1 材料與方法
1. 1 主要試劑
提取RNA 的TriPure Isolation Reagent 試劑盒、DEPC 等購自B.M公司,常規試劑如瓊脂糖等為進口或國產AR 級以上。
1. 2 RNA 的提取
以人胎盤組織提取總RNA ,方法按TriPure Isolation Reagent試劑盒說明書進行。對提取的RNA 在紫外分光光度計上測A260值和A260/ A280比值,確定所提取RNA 的濃度和純度。
1. 3 RNA 的瓊脂糖凝膠電泳
電泳方法、步驟大體同文獻[ 2 ]中的瓊脂糖凝膠電泳。為最大限度降低RNA 在電泳時被降解,結合甲醛變性瓊脂凝膠電泳分離RNA 方法[1 ] ,在常規瓊脂糖凝膠電泳的基礎上進行如下改進。①電泳RNA 所用器械如制膠的模具、梳子、電泳槽等用肥皂粉洗干凈后用雙蒸水沖洗二遍后在室溫晾干備用。②用新的1XTBE 配制1. 2 %瓊脂糖凝膠,倒膠時溴化乙錠(EB)直接加入凝膠中。③制備好的瓊脂糖凝膠板放入電泳槽后再加入經高壓滅菌過的1XTBE ,液面只能剛好同膠面平齊,緩沖液不要淹過膠面。④點樣時,樣品RNA 每10μl 加入2μl 上樣緩沖液,上樣緩沖液是用DEPC 處理的水配制的50 %甘油,另外單獨點一樣品孔含有3μl 溴酚藍的上樣緩沖液作為電泳指示劑,電泳電壓4 V/ cm ,電泳時間2 h 左右便可取出凝膠在紫外燈下觀看所提取的RNA 的質量或進行拍照記錄。
2 結果
取人胎盤組織RNA 3μg 和6μg ,按本方法以1. 2 %的瓊脂糖凝膠進行電泳,可見28S、18S、5. 8S(5S) 三條清晰的rRNA 條帶。電泳結果見圖1。
3 討論
RNA 作為分子生物學的主要研究對象之一,但它極易受到RNase 的水解,在進行RNA 操作時主要是避免外源RNase 的污染,特別是在得到RNA 沉淀以后,無RNase 抑制劑存在的條件下尤其如此。因此, 在RNA 操作過程中必須對所有實驗材料進行徹底的處理,滅活RNase ,如EP 管、Tip 頭等;另外,有一個良好的操作環境也是非常的重要。
RNA 質量如何、是否被降解通常采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳方法來鑒定。此電泳的主要目的之一是為了Northern blot 之用。但在RNA 的其他用途中,如cDNA 合成和寡聚(OligdT) 纖維素選擇分離mRNA 等實驗中要對RNA 進行質量鑒定,此方法就現得繁瑣、費時、費力,而用常規瓊脂糖凝膠電泳RNA 會水解而達不到鑒定的目的,如果用本研究改進的1. 2 %瓊脂糖凝膠方法電泳鑒定,簡單、高效、經濟實用,并且能達到同用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳相同的實驗結果。因此本方法在常規瓊脂糖凝膠電泳的基礎上所作的每一項改進均是為了避免RNA 在電泳過程中被水解,比如對所有電泳器具徹底的清洗處理就是為了盡量清除器具上存在的RNase ;在RNA 樣品中加入用DEPC 水配制的50 %甘油作為上樣緩沖液,目的也是為了在RNA樣品中避免加入其他試劑時造成RNase 的污染。
在提取的真核細胞總RNA 中核糖體RNA(rRNA)是28 S 清晰的帶型,通常認為所提取的RNA 未被降解,可以用提取的RNA 進行后續實驗。我們實驗室還提取過多種組織RNA 如外周血淋巴細胞培養后的RNA、脂肪組織RNA、肝臟RNA 等,經此方法鑒定的RNA 的質量同分子克隆手冊等參考書用變性瓊脂糖凝膠鑒定的RNA 完全無異,結果穩定可靠。占總RNA 的90 %以上,它們主要由28 S、18 S、5. 8 S、5S 組成,28S(約4. 5 kb) 、18S(約2. 1 kb) 、5. 8 S(5 S) 這三類rRNA 的摩爾濃度大致相等,但他們的分子量相差較大,在紫外燈下的亮度依次為28 S > 18 S > 5. 8 S(5 S) 。在電泳后能觀察到28 S、18 S、5. 8 S(5 S) ,特別是28 S 清晰的帶型,通常認為所提取的RNA 未被降解,可以用提取的RNA 進行后續實驗。我們實驗室還提取過多種組織RNA 如外周血淋巴細胞培養后的RNA、脂肪組織RNA、肝臟RNA 等,經此方法鑒定的
RNA 的質量同分子克隆手冊等參考書用變性瓊脂糖凝膠鑒定的RNA 完全無異,結果穩定可靠.