三箱社交實驗及自發活動實驗-雷帕霉素對自閉癥大鼠病癥行為的改善作用
摘要：
目的探討雷帕霉素(rapamycin)對自閉癥大鼠病癥行為的改善作用及相關機制。
方法采用丙戊酸鈉( sodium valproate VPA)一次性腹腔注射孕12.5 d大鼠制備自閉癥幼大鼠模型，雷帕霉素處理組于VPA注射后每天給大鼠口服4 mg/kg雷帕霉素直至斷奶。將出生幼鼠分為4組:對照組，VPA處理組，雷帕霉素處理組與VPA聯合雷帕霉素處理組。在幼鼠出生后35 d進行社會交往行為檢測、神經行為學檢測，并分離提取腦組織蛋白通過Western blot分析mTOR磷酸化水平及自噬標志蛋白LC3表達情況;電鏡分析前額葉組織中自噬小體形成情況。結果成功制備自閉癥大鼠模型。與對照相比，VPA處理組社會交往能力下降、在中央區活動時間增加、站立次數減少(P <0.05)，符合自閉癥行為特征;雷帕霉素單獨處理組無明顯行為學變化;但雷帕霉素聯合處理能明顯改善VPA處理導致的自閉癥行為癥狀(P <0.05) o Western blot結果顯示，與對照組相比，VPA處理可增強大鼠前額葉、海馬及小腦組織中mTOR磷酸化水平，并降低LC3-II表達水平;而雷帕霉素聯合處理則能抑制上述腦組織中mTOR的磷酸化并增強LC3-II表達水平。電鏡分析結果表明，VPA處理可減少幼鼠前額葉組織中的自噬小體，而雷帕霉素聯合處理則能明顯增加自噬小體的形成。
結論雷帕霉素可改善自閉癥模型大鼠的病癥行為，機制可能與抑制mTOR活性并增強細胞自噬相關。
關鍵詞：雷帕霉素;自閉癥;自噬
自閉癥(autism)又稱兒童孤獨癥，是以嬰幼兒期就表現出交往障礙、語言障礙和(或)重復刻板行為為主要臨床特征的一種腦發育障礙綜合征，其發病率為2 / 1 000 } 6 / 1 000 }'}。目前我國約有60多萬自閉癥兒童，男孩多于女孩，并且發病率還呈上升趨勢[}z}。自閉癥的發病原因復雜，涉及遺傳、免疫、環境、飲食、教育等多個方面，至今尚未完全闡明[3]。
研究表明，Tscl基因敲除小鼠具有自閉癥類似癥狀，但詳細的分子機制尚不明確[#]。由于Tscl基因是Akt-mammalian target of rapamycin ( mTOR)信號通路的重要中間分子[[5]，該基因缺失后會導致mTOR活性升高，進而引起細胞內多種代謝途徑的改變，尤其是細胞自噬被抑制。因此本課題組設想mTOR活性升高導致的細胞自噬水平下降可能是引起自閉癥發病的重要原因。為證明這一假說，本研究以自閉癥大鼠為模型，觀察腦組織中細胞自噬水平變化情況，并探討mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin)對自閉癥大鼠病癥行為的改善作用。
材料與方法
1.1實驗動物
本實驗所用Wistar大鼠由第三軍醫大學實驗動物中心提供。成年清潔級Wistar雄性大鼠(體質量300-350 g) 12只，雌性大鼠(體質量200一250 g) 12只，飼養于第三軍醫大學實驗動物中心。
1.2藥品及試劑
丙戊酸鈉( sodium valproate，VPA) , LC3抗體購自Sigma公司，磷酸化mTOR抗體、GAPDH抗體購自CellSignaling公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒和細胞裂解液購自江蘇碧云天生物技術公司，PVDF膜購自美國Bio}ad公司，蛋白Marke:購自北京中衫公司。
1.3動物模型制備與分組
參照Sehneider等的方法，將雌、雄大鼠合籠過夜，次日早晨對雌鼠進行陰道涂片檢查，發現陰栓者記為妊娠第1天(E1)，并將孕母鼠單獨飼養。將孕鼠分為4組，分別為對照組、VPA處理組(即模型組)、雷帕霉素處理組及VPA聯合雷帕霉素處理組，每組3只。
VPA處理組與VPA聯合雷帕霉素處理組在E12. 5 d時給孕鼠腹腔注射VPA，劑量為600 mg/kg;同時給對照組與雷帕霉素處理組孕鼠腹腔注射等量的生理鹽水;雷帕霉素處理組及VPA聯合雷帕霉素處理組在E12. 5 d后每天給孕鼠口服雷帕霉素(4 mg/kg)直至仔鼠斷奶，其他小組口服等劑量溶劑(麻油)。VPA處理組孕鼠產下的仔鼠即為孤獨癥模型組，而對照組孕
鼠產下的仔鼠為正常對照組。幼鼠出生后第1天記為P1。各組幼鼠統一于出生后23 d (P23 )斷奶。
1.4社會交往行為檢測
在幼鼠出生后35 d，分別從每組各選擇6只進行檢測。檢測鼠均為雄性，出生時間相差不超過1d，體質量差別小于15 g，分籠飼養。檢測在大小為60 cm x60 cm x 60 cm的透明三室箱內進行。實驗前1d，所有被檢測鼠放入檢測室適應環境。實驗時將1只被測鼠放入中間小室先適應10 min。然后在左側小室放置空鐵絲籠子，右側小室放入陌生幼鼠并用同樣的鐵絲籠子罩住。打開中間小室進入左、右小室的通道，攝像記錄10 min內被檢測鼠的行為，通過Supermaze軟件系統分別統計被檢測鼠自梳理(非社交行為)、嗅鐵絲籠子和陌生鼠(社交行為)時間。
1.5神經行為學檢測
同樣在幼鼠出生后35 d檢測，分別從模型組與對照組各選擇5只進行檢測，被檢測大鼠的選擇標準同1.4。檢測在大小為25 cm x 25 cm x 38 cm的封閉箱內進行，箱子中央12 cm x 12 cm區域為中央區。實驗前1d，所有被檢測鼠放入檢測室適應環境。檢測時將被檢測鼠放入檢測箱中央，攝像記錄5 min內被檢測鼠的行為，通過Supermaze軟件系統分別統計被檢測鼠在中央區活動時間及直立次數。
1.6Western blot檢測
將出生后35 d的幼鼠斷頸處死，立即分離前額葉皮層、海馬和小腦組織。將各組織分別按100 mg/mL比例加入組織裂解液進行勻漿。冰上靜置30 min后于4 0C 12 000 r/min離心30 min。取上清，測定蛋白濃度后置一80℃冰箱備用。將含50 ug總蛋白的組織樣品經SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳分離后轉移到PVDF膜上。經5%脫脂奶粉封閉后加入一抗4℃孵育過夜，PEST洗滌后再加入二抗，室溫孵育1h。再經PEST漂洗后加入化學發光液進行曝光顯影。
1.7電鏡分析
將出生后35 d的幼鼠斷頸處死，立即分離前額葉皮層、海馬和小腦組織。將各組織分別進行固定、塊染、脫水、浸透、包埋后切片，置于銅網上進行透射電鏡觀察。全部樣品處理過程及觀察、拍照均在第三軍醫大學中心實驗室完成。
1.8統計學分析
采用SPSS 19. 0統計軟件進行數據分析，所有數據均用x士s表示，均數比較采用單因素方差分析。