三箱社交實驗及自發活動實驗-雷帕霉素對自閉癥大鼠病癥行為的改善作用
2結果
2. 1雷帕霉素處理顯著改善自閉癥大鼠的社會交往能力
社會交往實驗分析發現，與對照組相比，VPA處理組幼鼠社會交往能力顯著下降(P <0.05)，體現為自我梳理時間增加，不愿意與陌生幼鼠交往，不愿接觸新事物，符合自閉癥兒童的行為特點。雷帕霉素單獨處理組幼鼠與對照組相比社會交往能力無顯著差異;而雷帕霉素聯合處理則可以改善VPA處理導致的社會交往能力下降(P <0.05，圖1) 。
2. 2雷帕霉素處理明顯改善自閉癥大鼠的神經病征行為
2. 2. 1雷帕霉素處理減少自閉癥幼鼠在中央區活動時間如圖2所示，對照組正常幼鼠在中央區活動時間較短，而VPA處理組幼鼠在中央區活動時間明顯增加，與對照組存在明顯差異(P <0.05)，符合自閉癥的行為特點。雷帕霉素單獨處理組幼鼠與對照組相比活動方式無顯著差異;而雷帕霉素聯合處理則可以減少自閉癥幼鼠在中央區活動時間(P <0.05)，明顯改善自閉癥幼鼠的活動方式。
2. 2. 2雷帕霉素處理增加自閉癥大鼠站立次數
如圖3所示，正常對照組幼鼠的站立次數顯著高于VPA處理組的自閉癥模型鼠(P <0.05)，而雷帕霉素聯合處理則可以明顯增加自閉癥幼鼠的站立次數(P<0. 05 )。
2. 3雷帕霉素處理增強自閉癥大鼠前額葉皮層、海馬和小腦組織的自噬水平
分別分離各組幼鼠的前額葉皮層、海馬和小腦組織進行Western blot分析。如圖4所示，與正常對照組相比，VPA處理組自閉癥幼鼠的前額葉皮層、海馬和小腦組織中的mTOR蛋白磷酸化明顯增強，而雷帕霉素可以特異性抑制mTOR蛋白磷酸化。對自噬標志性蛋白LC3-II的水平進行分析發現，VPA處理組LC3-II水平明顯降低(P<0.05)，表明在自閉癥幼鼠的腦組織中自噬被抑制。使用雷帕霉素處理后，可以明顯增加自閉癥幼鼠前額葉皮層、海馬和小腦組織中LC3-II的水平(P < 0. OS )，促進自噬發生。對LC3-II的水平進行定量分析也進一步支持了這一結果。
為進一步證實自噬在雷帕霉素改善自閉癥幼鼠病癥行為中的作用，對幼鼠前額葉組織中的自噬小體進行電鏡觀察，結果見圖5。從圖5可看出，正常幼鼠前額葉組織中存在少量自噬小體(箭頭所示),VPA處理組則觀察不到自噬小體的存在，而雷帕霉素處理組及VPA聯合雷帕霉素處理均存在大量自噬小體。這一結果說明雷帕霉素處理確實可以增加自閉癥幼鼠腦組織中的自噬水平。
3討論
在針對自閉癥的研究過程中，學者們建立了多種自閉癥動物模型，如Tscl基因敲除鼠模型、病毒感染模型、VPA藥物處理模型等。在這些模型中，VPA一次性注射藥物模型是目前公認的一種較理想的自閉癥動物模型。該模型可以在行為上模擬自閉癥的刻板、重復等行為特征，且腦組織中的神經形態變化也與自閉癥尸檢報告也相似。社會交往實驗是測驗模型動
物社會交往能力的經典實驗，實驗中的陌生鼠與空籠子分別代表了新伙伴與新事物，通過分析規定時間內被檢測鼠自我梳理、與陌生鼠及空籠子的接觸時間，從而判斷其社會交往能力。在本研究中，經VPA處理的模型鼠社會交往能力明顯減弱，與自閉癥癥狀相符。
神經行為學檢測實驗中，在中央區所呆時間長短反映了被測動物的空間認知能力，正常鼠對明亮、開放的新環境具有先天的躲避傾向，喜歡避開中央區、在四周角落中探尋，而對新環境認知能力差的自閉癥鼠則停留在中央區的時間就會延長;站立次數反映了被測鼠在新環境中的探索能力，正常鼠站立次數多、探索能力強，而自閉癥鼠則站立次數減少、探索能力減弱。本研究中VPA處理的自閉癥模型鼠也具有相似的行為特征。VPA誘導大鼠發生自閉癥的藥理機制目前尚不明確。本實驗結果表明，VPA可以增強大鼠前額葉、海馬與小腦組織中的mTOR磷酸化，從而增強mTOR活性，并抑制自噬的標志性蛋白LC3-II的生成以及自噬小體的形成，這與TSC基因敲除自閉癥模型鼠中mTOR的活性增強具有相似性，表明這可能是VPA誘導自閉癥發生的重要機制。
雷帕霉素是一種新型大環內酷類免疫抑制劑。研究表明，在帕金森、亨廷頓病等神經退行性疾病動物模型中，雷帕霉素對神經元細胞均具有保護作用。在外傷性腦組織損傷動物模型中雷帕霉素處理也可以減少神經細胞的損害。但目前尚未見雷帕霉素處理改善自閉癥癥狀的相關報道。雷帕霉素在細胞內的特異性分子靶點是mTOR，雷帕霉素可以特異性抑制mTOR的磷酸化并抑制其活性。本實驗結果也表明，雷帕霉素處理后大鼠前額葉皮質、海馬及小腦組織中mTOR磷酸化水平明顯降低，mTOR活性明顯下降。由于mTOR是調節細胞內代謝的關鍵分子，尤其與細胞自噬的發生密切相關，因此，雷帕霉素處理后神經組織中自噬水平的增加可能是其改善自閉癥癥狀的重要機理。
自噬是細胞中降解長壽命蛋白與細胞器并回收利用相關降解產物的重要分解代謝機制，在細胞的生長、發育與疾病的發生中發揮重要作用。自噬水平的降低是多種神經退行性疾病如帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病等發病的重要原因。盡管自噬與自閉癥的發病關系目前尚少見報道，但在多種自閉癥模型動物中均發現了與自噬發生相關的信號通路的改變。如自閉癥模型動物腦組織中Wnt信號通路的增強,TSC基因敲除自閉癥模型鼠腦組織中mTOR信號通路的激活等，均可降低細胞中的自噬水平。由于mTOR通路是自噬發生的關鍵性上游通路，抑制該通路后可顯著增強細胞內的自噬水平，因此本實驗選用mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素來抑制該通路并進而增強神經細胞中的自噬水平。實驗結果也證實這一策略具有可行性，從而為自閉癥的治療提供了一定的理論與實驗依據。