實驗方法原理 在核內，RNA 聚合酶 Ⅱ 的轉錄產物同大量不同類型的核前體 mRNA/mRNA 結合蛋白，不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucUoprotein，hnRNP) 結合形成 hnRNP 復合物。
實驗材料 HeLa S3 細胞抗體
試劑、試劑盒 免疫純化緩沖液
儀器、耗材 蛋白 A-Sepharose 凝膠單向凝膠電泳雙向非平衡 pH 凝膠電泳
實驗步驟
一、材料與設備
1. 細胞與代謝標記蛋白質
(1) HeLa S3 細胞的培養：含有 10% HeLa S3 細胞和 1% 青霉素/鏈霉素的 DMEM 培養基。
(2) HeLa S3 細胞標記：無甲硫氨酸和胱氨酸的 DMEM，10% DMEM，5% 胎牛血清 ( FCS )，1% 青霉素/鏈霉素，20 μCi/ml TRANS ( ICN，COSTAMESA，CA，USA )。
2. 抗體和蛋白 A-Sepharose 凝膠
(1) 抗體：任何對特定的 hnRNP 蛋白有特異性并有高親和力的單克隆抗體都可以用作免疫親和純化。成功應用的單克隆抗體有4B10 ( 抗 hnRNP A1)、4F4 ( 抗 hnRNP C1/C2 ) 和 4D11 ( 抗 hnRNP)。
(2) 蛋白 A-Sepharose ( pharmacyia Biotech，Piscataway，NJ.USA）。
3. 免疫純化緩沖液
(1) 免疫純化緩沖液 1 ( IPB1 )：RSB-100 [ 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，100 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L MgCl2 ]，0.5% Triton X-100，1 μg/ml 亮抑酶肽 ( leupetin )，1 μg/ml 胃酶抑制劑（peppstatin )，0.5% ( V/V ) 抑蛋白酶肽（aprotinin )。
(2) 免疫純化緩沖液 2 ( IPB2 )：除了沒有 Triton X-100 外，其余成分同 IPB1。
(3) 免疫純化緩沖液 3 ( IPB3 )：PBS，1 mmol/L EDTA，1% 二甲基甜菜堿（Empigen BB )，0.1 mmol/L DTT。
(4) 免疫純化緩沖液 4 ( IPB4 )：PBS，1 mmol/L EDTA，1% Triton X-100，0.5% 去氧膽酸，0.1% SDS，0.5% 抑蛋白酶肽。IPB4 可配制 5X 的儲存液，在 4℃ 保存不超過一個月。
4. 單向凝膠電泳
(1) 試劑：10% ( m/V ) SDS ( 高壓滅菌后室溫保存 )；3% ( m/V ) 過硫酸銨（APS )，1 ml 每份， -20℃ 保存；TEMED。
(2) 分離膠用丙烯酰胺儲存液：167.5 g（33.5%）丙烯酰胺和 1.5 g（0.3%）甲叉雙丙烯酰胺溶于 45 ml 水中，攪拌直至完全溶解，加水至 500 ml，用 Whatman 1 號濾紙過濾。在棕色瓶中于 4℃ 可保存至少 2 個月。
(3) 分離膠緩沖液：1 mol/L Tris-HCl ( pH 9.1）。4℃ 至少可保存 3 個月。
(4) 濃縮膠用丙烯酰胺儲存液：60 g（30%）丙烯酰胺和 0.88 g（0.44%）甲叉雙丙烯酰胺溶于 175 ml 水中，攪拌直至完全溶解，補充水至 200 ml，用 Whaman 1 號濾紙過濾。在棕色瓶中于 4°C 可保存至少 2 個月。
(5) 濃縮膠緩沖液：0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8 )。4℃ 保存至少 3 個月。
(6) 2X 上樣緩沖液：5 ml 0.5 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8)，8 ml 10% SDS，4 ml 重蒸餾甘油，2 ml β-巰基乙醇，2 mg 溴酚藍，加水補充到 20 ml。-20°C 保存至少 4 個月。
(7) 4X 電泳緩沖液：96 g Tris 堿，460.8 g 甘氨酸，32 g SDS 溶于適量水中，最終補充到 8 L。室溫避光保存。
(8) 設備：垂直凝膠電泳裝置。
5. 雙向非平衡 pH 凝膠電泳
(1) 試劑：超純尿素；10% NP-40；40% Bin-Lyte 3/10 兩性電解質（Bio-Rad公司）； 10% APS；TEMEI）。
(2) 等電聚焦（isofocusing ) 丙烯酰胺儲存液：28.38 g 丙烯酰胺和 1.62 g 甲叉雙丙烯酰胺溶于 90 ml 水中，攪拌至完全溶解，補充水至 100 ml。用 Whatman 1 號濾紙過濾，在棕色瓶中可保存 3 個月。
(3) 上槽緩沖液 ( 0.01 mol/L 磷酸）：1 ml 85% 的磷酸溶于 470 ml 水中。
(4) 下槽緩沖液（0.02 mol/L NaOH）：12 ml 1 mol/L NaOH 加入 600 ml 水中并用真空泵脫氣 5 min。
(5) 樣品緩沖液：1.43 g 超純尿素，0.5 ml 10% Nonidet P-40，0.125 ml 40% ampholines，加水至 2.93 ml。分成 100 μl 每份，-70℃ 可保存 1 年。
(6) 95% 樣品擠出緩沖液：混合 12.7 ml 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8 )，8 ml 甘油，10 ml 0.1% 溴酚藍，20 ml 10% SDS，用水補充至 95 ml，室溫保存。用前立即加 β-巰基乙醇至終濃度為 5%。
(7) 其他裝置：管狀凝膠電泳裝置，垂直凝膠電泳裝置，試管架，結核菌素注射器。
二、操作方法
1. 核質的制備
(1) HeLa 細胞培養至大部分發生融合，采用 [ 35S ] 甲硫氨酸進行蛋白質標記，傾去培養液后用無菌 PBS 冼滌一次，每 10 cm 培養皿加 5 ml 細胞標記培養基，培養過夜（8~12 h）。下面所有操作都采用 1.5 ml 離心管在 4°C 進行，每次親和純化約需半皿細胞。
(2) 每 10 cm 培養皿用 5 ml PBS 洗兩次，加入 1.5 ml IPB1 后，用細胞刮刀徹底刮下細胞。用與注射器相連的 25 號針頭吹打細胞懸液 4 次，操作時避免起泡沫。
(3) 3000 g 離心裂解液 3 min。
(4) 用 0.5 ml IPB2 重懸 XL 胞核沉淀，冰浴中超聲 3 次，兩次之間間隔 15 秒。
(5) 取 0.5 ml 30% 蔗糖 ( 用 IPB2 配制）加至離心管中，將超聲后的溶液輕輕鋪在蔗糖溶液表面，于 4800 g 離心 15 min。
(6) 移出在蔗糖液之上的核質部分（約 0.5 ml），加入 Triton X-100 至終濃度為 0.5%。
2. hnRNP 復合物的免疫純化和凝膠分析
本方法是用抗 hnRNP 的單克隆抗體純化 hnRNP 復合物。免疫純化在非離子型去污劑條件下進行以避免破壞蛋白-蛋白和蛋白-RNA 相互作用。操作應迅速以最大程度降低核酸酶的作用，單克隆抗體預先結合在蛋白 A Sepharose 顆粒上，與核質的孵育不超 過 15 min。
(1) 所有步驟均在 4℃ 操作。加 1 ml IPB1 至離心管中，再加 1~5 μl 腹水，3 μl 兔抗鼠 IgG，50 μl 蛋白 A-Scpharose（50%，用PBS 配制混合后，置于混合器上于 4℃ 反應 1 h。
(2) 用 1 ml lPB1 渦旋振蕩洗滌 3 次，離心 3 s，棄上清。
(3) 在每管含約 25 μl 結合抗體的蛋白 A-Sepharose 顆粒中加 250 μl 標記的核質，在 4℃ 混合 15 min。
(4) Sepharose 凝膠顆粒用 IPB1 洗 5 次，每次 1 ml，然后用 1 ml RSB-100 洗一次。
(5) 用配有 27 號針頭的注射器除去過剩的液體，但不能使蛋白 A-Sepharose 干燥時間過長。
(6) 采用單向凝膠電泳進行分析，加 40 μl 2X 電泳上樣緩沖液，100℃ 加熱 3 min，微量離心機上最大轉速離心 2 min，每個泳道上樣 20 μl。
(7) 采用雙向凝膠電泳分析，加 20 μl 同樣的緩沖液和 2μl 20 mmol/L DTT。混合并在室溫孵育 5 min。離心 30 s，上清再離心30 s。每個泳道上樣 18~20 μl。按操作5 “雙向凝膠電泳” 步驟 (1)~(5) 的方法電泳。
2. 特定 hnRNP 蛋白的免疫純化和凝膠分析
通過免疫親和純化僅被單克隆抗體特異性識別的蛋白質 ( 特別是此蛋白不是已知的 hnRNP 復合體的成分時 ) 非常有用，可以采用以下兩種方法，從標記的細胞提取物中直接免疫純化或從純化的 hnRNP 復合物中純化。下面分別加以介紹：
(1) 從標記的細胞提取物中純化。前面的步驟同操作1 “核質的制備” 中的步驟(1) 和(2)，但用 IPB3 或 IPB1 代替 IPB1 重懸細胞核沉淀，然后直接超聲細胞裂解物 [ 操作1 “核質的制備” 中的步驟 (4) ] 。在離心管中以最大轉速離心 10 min 去除沉淀，然后按操作2 “hnRNP 復合物的免疫純化和凝膠分析” 的方法進行免疫純化（用 IPB3 或 IPB4 代替 IPB1 )。
(2) 從免疫純化的 hnRNP 中進行免疫純化。按操作1 “hnRNP 復合物的免疫純化和凝膠分析” 步驟(1)~(5) 的方法純化 hnRNP 復合物。加 50~100 μl 含 1% SDS 的 RSB-100 并于 100℃ 加熱 3 min 以解離復合物，然后冷卻到室溫，加 IPB4 稀釋 10 倍（使 SDS 濃度降到約 0.1%）。最后按操作2 “hnRNP 復合物的免疫純化和凝膠分析” 的方法純化蛋白（用 IPB4 代替 IPB1 )。
4. 單向凝膠電泳
本實驗中采用的不連續緩沖凝膠系統對低分子質暈和高分子質量的 hnRNP 均有較好的分辨率，且在真空凝膠干燥器中干燥時不易破裂。
(1) 12.5% 分離膠的配制。將 14.8 ml 分離膠用丙烯酰胺儲存液、15.2 ml 電泳緩沖液、8.3 ml 水、0.4 ml 10% SDS、1 ml 3% 過硫酸銨（APS) 和 20 μ TEMED 混合。在電泳裝置中灌制凝膠，上層以 0.1% SDS 覆蓋，待其聚合。
(2) 濃縮膠的配制。將 1.3 ml 濃縮膠用丙烯酰胺儲存液、2.5 ml 0.5 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8)、6.1 ml 水、0.1 ml 10% SDS、0.1 ml 過硫酸銨（APS ) 和 25 μl TEMED 混合。在聚合的分離膠上灌制約 1 cm 高的濃縮膠，插上梳子。
(3) 使用 Hoefcr SE400 凝膠電泳裝置，20 μl 蛋白樣品先采用 80 伏電壓電泳使其濃縮，然后以 150V 電壓電泳約 5 h，直至溴酚藍完全泳出凝膠。
(4) 固定，染色。凝膠在 10% 乙酸、25% 異丙醇和 0.025% ( m/V ) 考馬斯亮藍中固定、染色過夜，然后用 10% 乙酸脫色 2 h。
(5) 顯影。凝膠在 DMSO 中浸泡 15 min，倒掉 DMSO 并加入新的 DMSO 再浸泡 15 min。倒掉 DMSO，再加入含 22% 2，5-二苯惡唑（PPO ) 的 DMSO 浸泡 1 h，再倒掉，然后以流水洗 1 h。用加熱真空凝膠干燥器干燥 1.5 h。
5. 雙向凝膠電泳
因為 hnRNP 復合物由大量的蛋白質構成，所以采用雙向電泳進行分析更能反映這些復合物的復雜性。由于人 hnRNP 復合物中含有大量的堿性蛋白，因此采用不平衡 pH 凝膠電泳進行第一向電泳。
(1) 第一向凝膠的制備。在一個放有攪拌子的 10 ml 燒杯中加入 1.38 g 超純尿素、0.5 ml 10% NP40、125 μl 40% 兩性電解質、0.49 ml 水，0.33 ml 等電聚焦丙烯酰胺儲存液，這足夠灌制 9 管凝膠。以封口膜蓋住燒杯，攪拌混合 30 min 直至尿素完全溶解。不要加熱丙烯酰胺溶液。
(2) 在混合丙烯酰胺溶液時，將制作模型用黏土平鋪在干凈的工作臺上并用封口膜覆蓋。將兩根橡皮筋繞在試管架的外圍并將試管架壓入黏土中，同時在結核菌素注射器的前端加上一個 200 μl 的毛細管（離底部 11.5 cm 處作一記號）。
(3) 準備好凝膠溶液后，加入 4 μl 10% APS 和 5 μl TEMED，混勻，用注射器吸入丙烯酰胺溶液至液面剛過 11.5 cm 記號處。然后將毛細管通過固定在試管架外圍的橡皮筋并固定在底端的黏土上，調整液面至剛剛為 5 cm 記號處，并檢査是否有氣泡。
(4) 所有凝膠灌注好后，在每個凝膠頂部覆蓋 15 μl 8 mol/L 的尿素，并用封口膜蓋住。聚合 4 h。
(5) 凝膠。聚合好后，去掉覆蓋的尿素。選用等長的凝膠。
(6) 在管狀凝膠裝置的下槽加入脫過氣的 NaOH 溶液。
(7) 用一個帶 21 號彎曲針頭的注射器吸掉膠管底部的氣泡。
(8) 把膠管插入帶橡膠接頭的管架中，把管架放在下槽，上槽充滿 0.01 mol/L 磷酸溶液。
(9) 上樣前，用加長的移液管頭以上槽溶液沖洗管子。上樣，倒轉電極，400V 電泳 4 h。
(10) 電泳后，用一個 20 ml 的注射器慢慢地把凝膠擠入一個裝有 4.75 ml 樣品緩沖液的 15 ml 錐形瓶中。
(11) 在每管中加入 250 μl 的巰基乙醇，輕輕混合，室溫平衡 5 min，在干冰/乙醇浴中迅速冷凍，保存于 -80℃。
(12) 制備第二向凝膠。按操作4 “單向凝膠電泳” 中步驟(1)~(3) 的方法用厚度為 1.5 mm 的墊片灌制凝膠，在濃縮膠中插一個單孔的梳子，插入約 0.5 cm。
(13) 在 37℃ 水浴中迅速解凍第一向凝膠，輕輕攪動。
(14) 把凝膠小心地放在梳子的位置，用平頭鑷子把凝膠弄直。確定玻璃板間凝膠的位置，輕輕地把第一向凝膠推到濃縮膠的上面。
(15) 進行第二向電泳，直至溴酚藍跑出凝膠。然后固定、染色、顯影 [ 見4 “單向凝膠電泳” 中步驟( 4)~(5) ]。
