不對稱PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一對引物，PCR擴增后產生大量的單鏈DNA(SSDNA)。這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為50——100:1。在PCR反應的最初10——15個循環中，其 擴增產物主要是雙鏈DNA，但當限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導的PCR 就會產生大量的單鏈DNA。
不對稱PCR的關鍵是控制限制性引物的絕對量，需多次摸索優化兩條引物的比例。還有一種方法是先用等濃度的引物PCR擴增，制備雙鍵 DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA為模板，再以其中的一條引物進行第二次PCR，制備ssDNA。不對稱PCR制備的ssDNA，主要用于核酸序列測定。