中國農大王濤團隊：質譜助力探索豆科植物結瘤固氮秘密

　　分析測試百科網訊 今年2月，國際植物科學期刊《Plant Physiology》上在線發表了一篇題為“The MtDMI2-MtPUB2 negative feedback loop plays a role in nodulation homeostasis”的學術論文，中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室王濤教授和董江麗教授的研究團隊首次揭示了豆科植物與根瘤菌在共生結瘤過程中是如何通過結瘤受體激酶和E3泛素連接酶來調控結瘤平衡、控制結瘤數目的分子機制；而在去年7月，該團隊曾在國際植物科學頂級期刊《The Plant Cell》發表了關于植物應答干旱脅迫的分子機制研究突破的論文。為此，分析測試百科網采訪到中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室教授王濤的科研團隊，探索豆科植物結瘤固氮新思路。

中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室王濤教授和董江麗教授研究團隊

國家級重點實驗室 前沿性研究成果

　　中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室是一個以應用基礎科學研究為主，并承擔高層次人才培養任務的農業生物技術領域綜合性國家級開放實驗室。依托“生物化學與分子生物學”、“微生物學”、“作物遺傳育種學”、“植物病理學”、“基礎獸醫學”、“預防獸醫學”等6個國家級重點學科，共分“作物分子遺傳與基因工程”、“動物基因組學與基因工程”、“分子病毒學與免疫工程”和“農業微生物與基因工程”四個研究領域，承擔“973”、“863”、國家自然科學基金、國家轉基因專項等國家重大/重點課題，已成為我國農業生物技術研發的主要基地。

　　董江麗說：“我們課題組的研究方向是植物分子生物學，主要是豆科植物功能基因組的研究、分子設計育種、苜蓿根瘤菌共生固氮、苜蓿耐鹽抗旱抗冷機制研究等，現有教授兩名，碩士博士18名，基本上都是碩博連讀。我們的課題都是國家級重點項目，包括‘863’，973重點項目，國家自然科學基金重點項目等。”

　　“這次我們在《Plant Physiology》發表的研究是很有創新性、前沿性的項目。固氮是生物學界的重大問題，科學家的終極目標就是使得更多的作物能固氮，這樣就不用使用大量的尿素化肥。”董江麗表示：“在土壤缺氮的情況下，豆科植物會與根瘤菌共生，根瘤菌把氮氣固定成氨，這樣豆科植物就能在缺氮情況下生長得很好。固氮與植物生長的碳氮平衡是一致的，不能消耗太多能量結瘤固氮，那樣會影響植物生長，這中間需要一個平衡來維持，所以我們整個文章就是研究共生固氮內部的平衡。”

　　“在《The Plant Cell》發表的是關于植物面對干旱脅迫時如何發揮抗旱作用的研究，當遇到干旱，植物細胞會通過一系列信號系統激活轉錄因子，在細胞核中啟動抗旱基因的表達。但是我們發現的NAC轉錄因子通過脂肪鏈錨定在細胞膜上，當干旱信號到來，硫酯酶對脂肪鏈進行切割，讓它進入細胞核。錨定在質膜上的NAC轉錄因子相當于后備軍。一般情況下，信號系統激活，細胞核內的轉錄因子在前面沖鋒陷陣，但是當干旱嚴重時，錨定在質膜上的NAC轉錄因子這個后備軍也要上陣了。這個機制是在植物中首次發現的。”

　　董江麗強調：“在這些研究課題中，我非常感謝SCIEX公司，他們發現了PUB2蛋白的3個關鍵磷酸化位點，我們進一步實驗驗證發現結果十分準確。SCIEX的技術專家經常與我們的學生分析實驗數據。對學生來說，找錯一個位點要耽誤一兩年，畢業也要延長一年了。”

中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室教授王濤（左二）、教授董江麗（右二），博士生鄧杰（左一），博士生祝富貴（右一）

結瘤固氮，從豆科植物到禾本科植物

　　談及為何會開展豆科植物結瘤平衡的研究項目，董江麗表示：“固氮研究是植物界非常重大的課題。固氮就是把大氣中的氮氣轉化成氨，再形成氨基酸，減少了氮肥的使用，這是減量化施用氮肥的有效途徑。豆科植物和其他植物相比最大的特點就是能夠共生固氮，而我們的終極目標就是能夠讓其他的禾本科植物也能夠固氮，這也是該領域科學家的目標。”

　　禾本科植物是指玉米、大麥、水稻、高粱、甘蔗等植物，因為不能自身固氮，所以需要大量的氮肥，尤其在土壤缺氮的情況下，而氮肥施用不當會對環境造成污染。目前農業上有輪作制度，即先種禾本科植物，再種豆科植物，之后再種禾本科植物，如此循環，這樣也能讓土地變得肥沃。

　　董江麗說：“目前根瘤菌和豆科植物的關系是千百萬年來共生形成的，從進化角度而言，這可能是低氮環境下豆科植物和根瘤菌協同進化的結果，使得豆科植物和根瘤菌形成了共生關系。禾本科植物和根瘤菌不能共生固氮，如何把共生固氮的機理應用到禾本科植物是很多科學家的夢想。”

　　就《Plant Physiology》研究進展，董江麗強調，“這項研究最大的亮點是從時序性上解析了兩個蛋白磷酸化和泛素化的關系”，“蛋白質的磷酸化泛素化會形成一個負反饋環，如果放在時空角度來看，會發現它并不是一個環，是有時序性的。在接種根瘤菌早期，DMI2磷酸化MtPUB2的第316位絲氨酸，導致其泛素化功能喪失，DMI2積累，傳遞結瘤信號；當傳遞完結瘤信號后，DMI2磷酸化MtPUB2的第421位絲氨酸，激活PUB2的泛素化活性，泛素化降解DMI2。這一過程是非常耗能的，植物只有在缺氮的時候才會結瘤固氮。”

　　王濤強調：“我們實驗室的主要方向之一是豆科植物的結瘤固氮，這是全世界最大的生物學問題之一。我國在大豆方面的技術研究（包括結瘤固氮方面），與發達國家（如美國、歐洲、日本）相比都有差距。這是生物學大問題，也是國際競爭的前沿熱點問題，我們也在探索，誰在主導植物結瘤，結瘤的邏輯是什么，我們一直在思考這個問題。我們要認知生命科學的基本規律和邏輯，要建立科學的世界觀和方法論。方法論需要將生物學基礎知識，時序性和數學建模等學科交叉，提出一些假說需要一些證據來證實這個規律。建立邏輯關系，然后去驗證這個關系。”

抗旱，從黃花苜蓿到紫花苜蓿

　　談到紫花苜蓿的研究，董江麗表示：“紫花苜蓿是牧草之王，蛋白質含量高、纖維素高、營養好，所有的牛都愛吃。但是，紫花苜蓿的種子資源牢牢地把控在美國人手里，種子和苜蓿干草國內大多依賴進口。我國育成的紫花苜蓿品種和國外相比，品質產量還有較大的差距，差距大是我們科技創新的動力，我們實驗室很早就瞄準了苜蓿科技的前沿研究。”

　　“我們發表在《The Plant Cell》的文章研究的是從抗旱的黃花苜蓿中分離的錨定在細胞膜上的NAC轉錄因子在干旱脅迫下的工作機制，這一研究成果為紫花苜蓿抗旱育種提供了新思路。因為前人將一些定位在細胞核的轉錄因子，直接在植物中過表達，常常會導致下游基因的持續激活。也就是說即使外界環境沒有干旱脅迫，下游基因也能被持續激活，這樣植物的生長發育就會受到影響。當我們把從黃花苜蓿中分離的錨定在細胞膜上的NAC轉錄因子轉給紫花苜蓿之后，只有干旱脅迫的時候NAC轉錄因子才進入細胞核激活下游基因表達，正常條件下對生長沒有影響。所以說，基礎研究是為應用研究服務的。”

實驗室的紫花苜蓿樣本

SCIEX質譜助力研究 交叉學科推動技術發展

　　在豆科植物與根瘤菌共生結瘤的研究中，課題組與SCIEX公司密切合作，利用LC-MS/MS技術尋找MtDMI2磷酸化MtPUB2的關鍵位點。在SCIEX公司技術人員的幫助下，確定了MtPUB2蛋白的Ser316，Ser421和Thr488等三個磷酸化位點在結瘤過程中具有重要的調控作用。

　　中國農業大學2012級直博生祝富貴說：“我很早就與SCIEX公司開始合作了，第一個項目是利用SCIEX公司的質譜幫助我們尋找激酶的磷酸化底物位點，最后在1000多個磷酸化肽段中發現了激酶的關鍵磷酸化底物位點。后續其它項目還有應用AP-SWATH等技術，用于高通量的互作蛋白分析，后續數據正在整理中。”

　　SCIEX市場開發經理李春波說：“在這次合作中，使用的是我們的TripleTOF 5600+高分辨質譜。在生命科學研究領域，已經有越來越多的科學家將SCIEX的質譜分析技術應用于他們的科學研究，并獲得了巨大的研究進展。”

　　王濤表示：“儀器工具能夠給我們解決一些方法，形成重要的邏輯，質譜提供能夠符合我們假設的基本邏輯，這樣才能繼續往下推動。做學問需要一個假設，是未知的。假設以后邏輯要怎么建立，那就需要質譜給我們提供邏輯的起點，這是非常重要的。”

　　“現代生物學的重大進展都是在儀器的助力下實現的。特別是研究大分子技術，包括蛋白質。近10年的SCI文章中就可以發現，很多研究都是依賴于包括質譜、光學和信息技術等去實現的。”王濤介紹道：“細胞是一個非常精密工作的機器，具有非常繁雜有序的交通系統、運輸系統、能量交流系統。這些系統的發現，沒有先進儀器的支持是不可能的。生命科學與其他學科交叉的成果，生命科學要發展，務必要和物理、化學、光學熱力學、新材料學等相結合。換個角度來說，先進的儀器也是與生命科學交叉融合的一個產物。所以，習總書記在北大講話里特別提到要發展交叉學科。所有學科的交叉才能推動科學的進步，才能產生新的動能，新的力量。歷史證明，任何一個學科都是不可能單獨解決問題的，包括儀器設備。生物物理學基本上用物理學的設備來解讀生物學的問題，化學生物學使用化學的設備來解讀生物學的問題，所以我們認為生命科學會不斷得到發展的力量。這也是學科之間不斷交叉融合的結果。”

繼續提升儀器精度 早日實現缸里撈“針”

　　“我們知道生物結構、生命本質實際上是非常復雜的。比如植物蛋白，可能白天一個樣，晚上一個樣，還有大的數據量和小的數據量。今后，希望儀器應用能夠和生物規律真正結合，提高研究精度，這是非常重要的。我們希望儀器廠商能夠給我們提供更精準的技術支持，這也是很多用戶共同的需求。”王濤表示：“老話說得好，大海里撈針是不可能的。現在，我們也像是在海里撈針，但實際上經過努力是能摸得到的。但我們更希望能在一個小缸里、小碗里摸針。作為一個學者而言，這是我對技術的期盼。”

　　王濤說：“生命是未知的，生命的本質我們知道的很少，我們對生命的認知也是很少的。幾萬個蛋白質分子在里邊不斷轉變，物質流、信息流、能量流等等，生命太偉大了，而我們知道的還太少。我們希望儀器廠商能提供技術支持，能夠讓我們在小缸里邊摸針，那這個技術就很了不起了。這不光是對SCIEX公司而言，也是全世界的儀器設備廠商努力的方向。”

　　“生命研究的本質在于發現，發現需要工具的支持。生命科學的進步很多時候依賴于發現的技術，如質譜技術、光學技術。很多技術在生物學上得到了深入的應用。過去我們對于細胞、蛋白質的認識只是結構性的認知，但是真正認知蛋白質的結構關系，還有很遠的路程。生命本質上是一個蛋白質系統，解析蛋白質系統也是我們研究的一個方向。技術的發展能很好地推動我們發現的速度和發現的能力。”

　　王濤簡介：

　　中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室教授，博士生導師。中國農業大學副校長，北京市農學會副會長，第五屆農業轉基因生物安全委員會委員。擔任國家科技部“十三五”農業農村科技規劃組組長。現承擔科技部戰略研究課題《科技支撐鄉村振興戰略研究》。長期承擔國家科技部、農業部科技政策、戰略規劃研究任務，1996年以來，作為主要完成人，先后參加了農業部重點學科建設規劃、農業部重點實驗室建設規劃、國家生物技術發展綱要、國家轉基因專項設計、國家糧食豐產工程設計、國家農業“863”技術設計規劃、國家農業科技創新體系建設等研究工作，為國家農業農村科技工作做出了重要貢獻。

　　董江麗簡介：

　　中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室教授，博士生導師。主要研究領域是豆科功能基因組研究和分子設計育種，具體研究方向：1、苜蓿抗逆分子機制研究；2、苜蓿-根瘤菌共生固氮調控機制研究；3、分子育種技術創新和新品種培育。研究團隊近年來主持完成多項國家自然基金重點項目、面上項目、國家863計劃重點項目和國家轉基因植物研究與產業化專項課題。研究團隊搭建了完整的豆科植物基因組學、蛋白組學、功能基因組研究、TALEN和CRISPR-cas9突變體研究、分子設計育種技術平臺。相關研究成果在全國居于領先水平。研究團隊在植物學期刊發表SCI論文30多篇，授權發明ZL18項。