主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批、對照細胞以及臨床治療用細胞進行支原體檢查時，應同時進行培養法和指示細胞法（DNA染色法）。病毒類疫苗的病毒收獲液、原液采用培養法檢查支原體，必要時，亦可采用指示細胞法篩選培養基。也可采用經國家藥品檢定機構認可的其他方法
第一法 培養法
推薦培養基及其處方
（1）支原體肉湯培養基
豬胃消化液 500ml
氯化鈉2.5g
牛肉浸液（1:2）500ml
葡萄糖 5.0g
酵母浸粉5.0g
酚紅0.02g
pH值7.6±0.2。于121℃滅菌15分鐘。
（2）精氨酸支原體肉湯培養基
豬胃消化液 500ml
牛肉浸液（1:2）500ml
葡萄糖 1.0g
酵母浸粉5.0g
L-精氨酸2.0g
酚紅0.02g
氯化鈉2.5g
pH值7.1±0.2。于121℃滅菌15分鐘。
（3）支原體半流體培養基 按（1）項處方配制，培養基中不加酚紅，加入瓊脂2.5～3.0g。
（4）支原體瓊脂培養基 按（1）項處方配制，培養基中不加酚紅，加入瓊脂13.0～15.0g。
培養基靈敏度檢查（變色單位試驗法）（1）菌種肺炎支原體（ATCC 15531）、口腔支原體（ATCC 23714），由國家藥品檢定機構分發。
（2）操作 將菌種接種于適宜的支原體培養基中，經36℃±1℃培養至培養基變色，盲傳2代后，將培養物接種到待檢培養基中，做10倍系列稀釋，肺炎支原體稀釋至10-7～10-9，接種在支原體肉湯培養基內；口腔支原體稀釋至10-3～10-5，接種在精氨酸支原體肉湯培養基內。每個稀釋度接種3 支試管，置36 ℃ 士1 ℃ 培養7 ～14 天，觀察培養基變色結果。
( 3 )結果判定 以接種后培養基管數的2 / 3 以上呈現變色的最高稀釋度為該培養基的靈敏度。
液體培養基的靈敏度：肺炎支原體（ATCC 15531 ) 應達到10-8 ，口腔支原體（ATCC 23714 ）應達到10-4。
檢查法 （1）供試品如在分裝后24 小時以內進行支原體檢查者可貯存于2～8 ℃ ；超過24 小時應置一20 ℃ 以下貯存。
( 2 )檢查支原體采用支原體半流體培養基和支原體肉湯培養基（或支原體瓊脂培養基）。支原體半流體培養基（或瓊脂培養基）在使用前應煮沸10 ～15 分鐘，冷卻至56 ℃ 左右，然后加人滅能新生牛血清（培養基與血清體積比為8:2 ) ，并可酌情加入適量青霉素，充分搖勻。液體培養基除無需煮沸外，使用前亦應同樣補加上述成分。
取每支裝量為10ml 的支原體半流體培養墓（已冷至36 ℃ 士1 ℃ ）和支原體肉湯培養基各4 支，每支培養基接種供試品0.5 ～1.0ml ，置36 ℃ 士1 ℃ 培養21 天。于接種后的第7 天從4 支中取2 支進行次代培養，每1 支培養基轉種支原體半流體培養基及支原體肉湯培養基各2 支，置36 ℃ 士l ℃ 培養21 天，每隔3 天觀察1 次．
( 3 )結果判定 培養結束時，如接種供試品的培養基均無支原體生長，則供試品判為合格；如疑有支原體生長，可取加倍量供試品復試，如無支原體生長，供試品判為合格，如仍有支原體生長，則供試品判為不合格。
【附注】 質量檢定部門應會同培養基制造部門定期抽檢支原體培養基靈敏度。
第二法指示細胞培養法（DNA 染色法）
將供試品接種于指示細胞（無污染的Vero 細胞或經國家藥品檢定機構認可的其他細胞）中培養后，用特異熒光染料染色。如供試品污染支原體，在熒光顯微鏡下可見附在細胞表面的支原體DNA 著色。
試劑 （1）二苯甲酰胺熒光染料濃縮液 稱取二苯甲酰胺熒光染料5mg ，加人100ml 不含酚紅和碳酸氫鈉的Hank 's 平衡鹽溶液中，室溫下用磁力攪拌器攪拌30～40 分鐘，使完全溶解，-20℃ 避光保存。
（2）二苯甲酰胺熒光染料工作液 無酚紅和碳酸氫鈉的Hank ' s 溶液100ml 中加人二苯甲酰胺熒光染料濃縮液lml ，混勻。
（3）固定液 醋酸:甲醉（體積比1:3 ）混合溶液。
（4）封片液 量取0.1mol / L 枸櫞酸溶液22.2ml 、0.2mol / L 磷酸氫二鈉溶液27.8ml 、甘油50.0ml ，混勻，調pH 值至5.5 。
培養墓及指示細胞 （1） DMEM 完全培養基。
( 2 ) DMEM 無抗生素培養基。
( 3 )指示細胞（已證明無支原體污染的Vero細胞或其他傳代細胞） 取培養的Vero細胞經消化后，制成每lml 含105 的細胞懸液，以每孔0.5ml 接種6 孔細胞培養板或其他容器，每孔再加無抗生素培養基3ml ，于36℃ 士1 ℃ 、5 ％二氧化碳條件下培養過夜，備用。
供試品處理 （1）細胞培養物 將供試品經無抗生素培養液至少傳1 代，然后取細胞已長滿的且3 天未換液的細胞培養上清液待檢。
（2）毒種懸液 如該毒種對指示細胞可形成病變并影響結果判定時，應用對支原體無抑制作用的特異抗血清中和病毒后或用不產生細胞病變的另一種指示細胞進行檢查。
（3）其他供試品 檢查時所選用的指示細胞應為該供試品對其生長無影響的細胞。
測定法 于制備好的指示細胞培養板中加入供試品（細胞培養上清液）2ml （毒種或其他供試品至少lml） , 于36 ℃ 士1 ℃ 、5%二氧化碳條件下培養3～5 天。指示細胞培養物至少傳代1 次，末次傳代培養用含蓋玻片的6 孔培養板培養3～5 天后，吸出培養孔中的培養液，加人固定液5ml ，放置5 分鐘，吸出固定液，再加5ml 固定液固定10 分鐘，吸出固定液，使蓋玻片在空氣中干操，加二苯甲酰胺熒光染料（或其他DNA 染料）工作液5ml ，加蓋，室溫放置30 分鐘，吸出染液，每孔用水5ml 洗3 次，吸出水，蓋玻片于空氣中干燥，取潔凈載玻片加封片液1 滴，分別將蓋玻片面向下蓋在封片液上制成封片。用熒光顯微鏡觀察。
用無抗生素培養基2ml 替代供試品，同法操作，作為陰性對照．
用已知陽性的供試品標準菌株2ml 替代供試品，同法操作，作為陽性對照。
結果判定 （1）陰性對照 僅見指示細胞的細胞核呈現黃綠色熒光。
(2)陽性對照 熒光顯微鏡下除細胞外，可見大小不等、不規則的熒光著色顆粒。
當陰性及陽性對照結果均成立時，試驗有效。
如供試品為陰性，則供試品判為合格；如供試品為陽性或可疑時，應進行重試；如供試品仍為陽性時，供試品判為不合格。