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  • 發布時間:2021-04-28 16:31 原文鏈接: 中性粒細胞數量減少和功能失調的檢測方法及臨床意義

        中性粒細胞是人體防御系統的重要組成部分,與機體的非特異性抗感染過程有關,該類細胞具有強大的吞噬殺菌功能,其作用過程歷經趨化運動,識別并結合吞噬物質,進而攝入胞內,最終殺傷并降解病原體。

      目前,中性粒細胞作為急性炎癥的重要指標之一,國內大部分實驗室僅做常規的白細胞計數,個別實驗室采用趨化試驗和吞噬功能檢查,但遠不能反映中性粒細胞吞噬殺滅病原體的復雜過程。因此,有必要開展新的檢測技術,從各個環節找出中性粒細胞功能失調的原因,為臨床診斷由中性粒細胞減少和功能失調所造成的疾病提供幫助,現將這方面的進展作一概括綜述。

    一、與中性粒細胞數量減少相關的疾病

      正常人外周血白細胞總數為4.0-10.0×109/L,中性粒細胞約占60%-70%。中性粒細胞的過多或過少常與許多疾病的發生發展有關。當血液中中性粒細胞低于0.5×109/L,病人可因非特異性抗感染能力的極度低下而致惡重感染。但是也有些病人盡管中性粒細胞缺乏較為嚴重,但只要其皮膚和粘膜的天然屏障作用沒有遭到破壞也能避免感染的發生。

      中性粒細胞數量減少引起的疾病有網狀發育不全,Kostmann 綜合征,Shwachman-Diamond綜合征,Griscelli綜合征,Chediak-Higashi綜合征,高IgM綜合征,自身免疫性淋巴細胞增生等疾病。

    二、與中性粒細胞功能失調相關的疾病

      有些細菌被中性粒細胞吞噬后,能干擾吞噬體和溶酶體融合,或產生超氧化物歧化酶和過氧化氫酶以逃避 活性氧中介物和活性氧中介物的殺傷作用,從而出現中性粒細胞功能失調,引起機體非特異性抗感染能力低下,導致反復感染和一些免疫缺陷病。

      中性粒細胞的吞噬殺菌是一個較復雜的過程,任何一環節的作用機制被阻斷或發生障礙能引起許多免疫缺陷病。例如,中性粒細胞趨化障礙可引起白細胞粘連缺陷綜合征,Chediak-Higashi綜合征,高IgE綜合征以及糖原儲積病。中性粒細胞結合功能障礙主要造成白細胞粘連缺陷綜合征,脫顆粒功能障礙引起Chekiak-Higashi綜合征或中性粒細胞特異性缺陷。由各類酶缺陷造成的中性粒細胞殺菌活性障礙要引起慢性肉芽腫病。

    三、中性粒細胞數量和功能的檢測

      中性粒細胞數量的檢測常規采用外周血白細胞計數,亦可進行骨髓涂片,用蘇木精-伊紅染色,觀察骨髓祖細胞的發育過程,判斷是否存在因細胞成熟障礙而導致白細胞數量減少。

      中性粒細胞功能失調隨其發生原因不同可采用多種辯證法,從不同角度加以檢測,籍以了解其功能失調的主要環節,協助臨床采取針對防治措施。簡述如下。

      1. 趨化功能的檢測 中性粒細胞受到某些化學因子的作用以后,可以向因子源方向移動,這種現象稱趨化作用,該化學物質稱為趨化因子。受趨化因子作用后,中性粒細胞表面的L-選 擇素數量增加,血管內皮細胞開始表達P-選擇素或E-選擇素。這兩類選擇素結合可使細胞貼向血管壁。這時中性粒細胞迅速表達整合素,例如,淋巴細胞功能相關抗原LAF-1等,與內皮細胞的配體結合,使中性粒細胞變扁,緊密粘貼內皮細胞,繼而中性粒細胞變形移出血管外,以阿米巴運動的方向因子源移動。這種過程多發生在毛細血管后微靜脈血流緩慢處。

      檢測趨化作用通常用Borden小室法。該裝置被1個帶有5-8μm大小不等孔徑的濾膜分為上下兩室。上室置白細胞懸液,下室置趨化劑。通過趨化劑的擴散 ,在濾膜上形成一個濃度梯度。濾膜經染色后,顯微鏡下測量中性粒細胞在膜內行進的距離,求其趨化單位。

      國內也有用瓊脂糖凝膠平板法。在含小牛血清1%的瓊脂平板上,用打孔器以每3孔為一組打孔。在中央孔加細胞懸液,兩側分別加趨化因子或對照用培養液。經37℃溫育后固定染色,測量細胞移動距離。

      2. 結合功能檢測 在內皮細胞上表達的L-選擇素/唾液糖蛋白,VLA-4/VCAM,CR3/纖維素等大量粘附分子,能與活化的中性粒細胞上的相應配體強合。有報道將單細胞層的內皮細胞作為生理性底物,在類似Borden小室的裝置中,經一定的反應時間后,計數濾膜上皮內皮細胞結合的中性粒細胞數,作為其結合能力的測定指標。內皮細胞用白細胞介素-1(IL-1),脂多糖(LPS),腫瘤壞死因子(TNF)α預處理后,或是在濾 膜下放置吸引劑,都可以使移動和結合作用增強。

      3. 吞噬功能的檢驗 將中性粒細胞與已標記臺盼藍染料的細菌共溫,經洗滌除去未攝入的細菌,再計數吞噬細菌的中性粒細胞數。運用這項技術既能解釋抗體、補體成分、血漿蛋白在吞噬作用中的重要性,又能獲知病人血清的調理功能。

      4. 殺傷功能的檢測 中性粒細胞可通過溶酶體酶對吞入胞內的病原體或顆粒進行消化降解。胞內殺菌機制復雜,目前認為真正的殺菌過程,是通過胞漿內的氧依賴性及氧非依賴性胞內殺菌兩條途徑來完成。當吞噬細胞吞噬異物顆粒后,胞內代謝常由無氧酵解轉化成有氧氧化,胞內的殺傷過程常為一耗氧過程,髓過氧化物酶(MPO)-鹵素系統是起殺傷作用的重要物質。此外,吞噬細胞中低pH狀態(pH約4.5)常限制細菌活力,溶酶體酶可溶解革蘭氏陽性細菌的細胞壁,它們與胞內陽離子蛋白,轉鐵蛋白,吞噬素等構成了氧非依賴的胞內殺傷途徑。

      檢測殺菌功能可用化學發光法。中性粒細胞在吞噬業經調理的金黃色葡萄球菌過程中,伴有化學發光產生。其氧代謝活性與細菌的吞噬密切相關,殺菌能力與發光強度相平行。Martin 和Bhakdi就是利用上述方法,在生理溫度和中性環境下,通過化學發光儀檢測中性粒細胞對金黃色葡萄球菌的調理吞噬和殺傷作用。另外,Hamers等用組合試驗測定中性粒細胞對大腸埃希菌的吞噬、殺傷和降解。在該試驗中他們用大腸埃希菌ML35突變株。如果中性粒細胞內大腸埃希菌被殺死,則可測出β-半乳糖苷酶的活性。

      中性粒細胞在殺菌過程中能量消耗驟增,耗氧量也相對增加。借助DADPH氧化酶,O2降解為O2-,O2-隨后轉化為H2O2。因此臨床也常用硝基四氮唑藍(NBT)還原試驗來檢測中性粒細胞的胞內殺菌能力。當磷酸已糖旁路謝活力增強,葡萄糖6-磷酸氧化脫氫時,加生產方式NBT接受所脫的氫,使原先呈淡莧色的NBT還原成點狀或塊狀顆粒并沉積在胞漿內。

      在氧非依賴的胞內殺傷途徑中,存在于中性粒細胞嗜天青顆粒中的陽離子蛋白,如酪蛋白鈣,也能對病原體起到殺傷作用,因此可利用鈣螯合物染料與鈣離子結合后發出的熒光來測定細胞內游離的鈣離子渡 度。最常用的染料有用于分光光度計的吲哚-1和用于流式細胞儀的熒光-3。Roos等將帶有趨化吸引劑的中性粒細胞溫育后,發現鈣離子濃度迅速升高。由于細胞內儲存的鈣被釋放,形成第一個濃度高峰。緊接著又由于細胞外鈣的流入,形成第二個峰。

      5. 降解功能的檢測 降解過程即漿膜對細胞內顆粒消化的過程,這個過程可測定上清液里中性粒細胞的顆粒酶活性,或計數中性粒細胞表面的顆粒膜蛋白。后者主要用彈性蛋白酶(結合O1-抗胰蛋白酶)和乳酸合成酶分別標記由嗜天青特異性顆粒釋放的蛋白。Kuijpers等在實驗中發現十四酸鹽乙 酸鹽(PMA)和N-甲酰-蛋氨酰亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)只能降低漿膜對特異性顆粒的消化能力。而fMLP結合了松弛素B后,能同時降低漿膜對特異性顆粒和嗜天青顆粒的消化。

      6. 其他檢測 測定針對中性粒細胞功能活性的信號傳導途徑,或用單克隆抗 體測定中性粒細胞表面受體和結合蛋白的表達。如Fc受體和β1、β2整合素。

      此外,用流式細胞儀測定聚合或絲狀的肌動蛋白量可了解中性粒細胞狀態結構的改變,如先用PMA誘導,可使絲狀肌動蛋白迅速而持久地升高,更有助于提高檢測技術敏感性。

      因此,上述針對中性粒細胞各項功能檢測方法將有助于臨床醫生及時發現病人的中性粒細胞缺少及功能失調的疾病,盡早采取措施,防止其發生感染。

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