摘 要
用海藻酸鈉、單硬脂酸甘油酯作殼材料，氯化鈣作固化劑，對中性蛋白酶制劑進行了包埋研究，結果表明，在100 ml、0.7%的海藻酸鈉溶液中加入0.5 g單硬脂酸甘油酯，10 g中性蛋白酶粉，滴入1%的氯化鈣溶液中固化5 min，經干燥、涂膜能明顯提高抗胃蛋白酶分解能力和耐胃酸能力。
關鍵詞 中性蛋白酶；包埋；能力
中圖分類號 Q814.2
研究表明添加酶制劑可以提高家禽生產性能,降低飼料成本,減少環境污染,提高蛋品質等。酶制劑作為綠色飼料添加劑,使用越來越廣泛,國外甚至已將酶作為家禽日糧的常用成分。但飼用酶制劑本質是蛋白質,pH值苛刻,酶易失活,易被胃內蛋白酶分解。將酶制劑進行包埋后,能提高酶制劑的抗酸性和耐高溫能力。
在pH值小于4.0時中性蛋白酶基本上不表達活性，而家禽的腺胃和肌胃內pH值在2.5～4.0之間。為提高中性蛋白酶在飼喂過程中的利用率，我們對飼用中性蛋白酶包埋進行了研究。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
1.1.1 中性蛋白酶來源及緩沖溶液的配制
中性蛋白酶是陜西省科學院酶工程研究所的發酵液經噴霧干燥產品（100 000 U/g）。磷酸緩沖溶液(pH值7.5)：稱取6.02 g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）和0.5 g磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O），加蒸餾水溶解并定容至1 000 ml。
1.1.2 顯色劑制備
于500 ml回流裝置中加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)10 g、鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）2.5 g、水70 ml、85%磷酸5 ml、濃鹽酸10 ml，小火沸騰回流10 h，取下回流冷卻器，在通風櫥中加入硫酸鋰（Li2SO4）5 g、水5 ml和數滴濃溴水（99%），再微沸15 min，以除去多余的溴，冷卻，加水定容至100 ml。混勻，過濾。制得的試劑應呈金黃色。
使用時，應將上述溶液與兩份水混合，搖勻后再使用。
1.2 試驗方法
1.2.1 酶活性檢測方法
取試管A(空白)、試管B(3個平行樣)。在試管A中加入酶液1.00 ml，(30±0.2) ℃水浴2 min后加三氯乙酸2.00 ml(搖勻),(30±0.2) ℃水浴10 min后加1%酪素溶液1.00 ml，靜置10 min；取濾液1.00 ml，加0.4 mol/l碳酸鈉溶液5.00 ml、顯色劑1.00 ml，（30±0.2） ℃水浴顯色20 min，于680 nm波長處測其吸光度。在試管B中加入酶液1.00 ml，(30±0.2) ℃水浴2 min后加1%酪素溶液1.00 ml，(30±0.2) ℃水浴10 min后加三氯乙酸2.00 ml(搖勻),靜置10 min,取濾液1.00 ml,加0.4 mol/l碳酸鈉溶液5.00 ml、顯色劑1.00 ml，（30±0.2） ℃水浴顯色20 min，于680 nm波長處測其吸光度。
1.2.2 酪氨酸標準曲線的制作
精確稱取干燥至恒重的L-酪氨酸0.100 0 g，用鹽酸溶解定容至100 ml。取6支試管，用0.1 mol/l鹽酸配制出的20、30、40、50、60、70 μl/ml的L-酪氨酸標準液。各取1.00 ml上述標準液，各加0.4 mol/l碳酸鈉溶液5.00 ml、顯色劑1.00 ml，置于（40±0.2） ℃水浴中顯色20 min。分光光度計680 nm處顯色。
1.2.3 酶制劑的包埋方法
A：取1%的海藻酸鈉溶液100 ml，加入10 g蛋白酶，攪勻，用注射器滴入2%氯化鈣溶液中固化5 min，取出晾干。
B：取1%的海藻酸鈉溶液100 ml，加入0.7%的單硬脂酸甘油酯，溶解，加入10 g蛋白酶，攪勻，用注射器滴入2%氯化鈣溶液中固化5 min，取出晾干。
C：取1%的海藻酸鈉溶液100 ml，加入0.7%的單硬脂酸甘油酯，溶解，加入10 g蛋白酶，攪勻，用注射器滴入2%氯化鈣溶液中固化5 min，取出晾干，涂腸溶膜。
1.2.4 酶制劑的活性評價方法
由于包埋方法不一樣,制得酶樣品單位重量的原酶含量不一樣。為統一標準,先計算每種方法的原酶制劑百分含量a,每次檢測稱取樣品的質量計為m,每次樣品檢測總活力計為U。單位比活力(U/g)=U/(m×a)。
2 結果與分析
2.1 包埋方法對酶活性影響試驗
用3種方法制得的包埋樣品與原酶樣活性分析結果如圖1。酶經過包埋后,活性均下降了20%左右。而3種包埋法對酶的損失率相差不大,其中B、C法略大。酶活性損失主要在海藻酸鈉-蛋白酶混合物在氯化鈣溶液固化過程中,酶分子溶入氯化鈣溶液,因而在生產中應縮短固化時間。從A、B、C 3種方法制得的包埋酶活性相當來看,海藻酸鈉加單硬脂酸甘油酯作殼材并不影響酶的活性;涂腸溶膜亦不太影響酶的活性。
將酶制劑加至95 ml 0.01 mol/l鹽酸溶液中，同時加入100 U/ml的胃蛋白酶5.00 ml，保持60 min，檢測酶活性如圖2。原酶經加有胃蛋白酶的鹽酸溶液浸泡60 min后，酶活性下降至原來的10%左右。而經過包埋的酶活性是原酶的50％~60%。C法經涂腸溶膜雖在圖1中顯示的活性最低，但經過加有鹽酸胃蛋白酶的鹽酸溶液浸泡60 min后，活性最高。
2.3 包埋方法對酶活性釋放的影響（見圖3）
從圖3可看出，3種包埋方法得到的樣品在緩沖溶液中經輕輕攪拌，在60 min后基本上能達到最大釋放量。方法B得到的樣品在緩沖液中添加胰脂肪酶的釋放速度比不添加胰脂肪酶的速度略有提高。這說明胰脂肪酶能部分分解殼材中的單硬脂酸甘油酯，加快殼材崩解,從而加快酶的釋放。C法得到的樣品加入腸液和胰脂肪酶的釋放速度明顯提高,這表明腸液能明顯溶解腸溶膜,使殼材裸露于緩沖液中,再加上胰脂肪酶的作用,60 min后基本能接近最大釋放量。
3 結論
經初步研究得出:100 ml、0.7%的海藻酸鈉溶液中加入0.5 g單硬脂酸甘油酯、10 g中性蛋白酶粉，滴入1%的氯化鈣溶液中固化5 min，晾干得到的包埋酶抗胃蛋白酶分解能力明顯增強,耐酸能力也明顯增強。在試驗操作過程中發現，在氯化鈣溶液中固化時間不宜過長,以免酶分子擴散到溶液中過多,影響包埋率。