中科院學者連發兩篇CellRes文章獲CRISPR技術重要突破

　　基因編輯工具的快速發展令整個生物學研究領域瘋狂，目前第三代DNA剪刀的主角是CRISPR，這是一種比其前身更快更便宜的工具。近期來自中科院神經科學研究所的楊輝研究組與多個研究組合作，在Cell Research雜志上發表了多篇文章，獲得了CRISPR-Cas9技術的重要突破。

　　研究組成員通過與施霖宇團隊與蘇州非人靈長類研究平臺孫強團隊合作，設計了一種以同源臂介導的末端接合（Homology-Mediated End Joining, HMEJ）為基礎的基因敲入策略，它在很多種系統（體外培養的細胞、動物胚胎和體內組織）中比現有的基因敲入策略的效率都要高。基于更高效的編輯效率和更好的精確度，HMEJ介導的基因敲入方法為一系列應用，包括基因編輯動物模型的建立、疾病的靶向基因治療等提供了非常大的應用前景。

　　常用的同源重組（HR）策略介導的基因靶向整合在動物胚胎和組織中效率低下。而且NHEJ介導的修復系統會導致隨機方向的整合，以及在接合處引入各種形式的插入、刪除或突變，使得這種方法難以通過同框整合的方式形成內外源融合基因以形成嵌合蛋白。即使是之前報道的MMEJ策略，也只能在某些系統內提高效率。因此，研究者們試圖探究是否存在一種在多個系統內都可以有更高效的編輯效率和更好的精確度的基因靶向整合策略。

　　在這項研究中，研究人員基于CRISPR/Cas9系統，設計了一種新的以HMEJ為基礎的靶向精確整合策略，即利用帶有單個向導RNA（sgRNA）靶向位點和長同源臂（約800bp）的供體載體來實現高效的精確整合。

　　為了驗證這一想法，研究人員構建了四種類型的供體載體來比較敲入效率： HMEJ供體（sgRNA靶向位置序列加在800bp長度的同源臂兩端）、HR供體（只有800bp長度的同源臂）、NHEJ供體（只有sgRNA靶向位置序列）以及MMEJ供體（sgRNA靶向位置序列加在20bp的微同源臂兩端）。然后將這四種系統分別在體外培養的細胞系，小鼠和猴胚胎以及成體組織上進行效率比較。

　　他們發現在體外培養的小鼠ES細胞和N2a細胞中，HMEJ為基礎的定向整合效率與HR方法相比較并無顯著提高。然而，在原代星形膠質細胞和神經元細胞中，HMEJ方法具有很高的DNA敲入效率。更重要的是，在小鼠和猴子胚胎中展現了非常強大的基因敲入能力。此外，通過尾靜脈水動力注射法感染成體小鼠的肝細胞，發現HMEJ介導的基因敲入效率遠高于以HR、NHEJ和MMEJ為基礎的策略。采用AAV定點注射感染小鼠的視皮層區（V1），結果顯示HMEJ介導的在成體非分裂的成熟神經元中靶向整合效率可以達到50%左右。最后，研究者對HMEJ介導的基因靶向整合的機制進行了探討。

　　這一工作建立了一種新的基于HMEJ的靶向精確整合策略，即利用帶有單個向導RNA（sgRNA）靶向位點和長同源臂（約800bp）的供體載體來實現高效的精確整合。HMEJ介導的基因敲入方法擁有更高效的編輯效率和更好的精確度，為包括基因編輯動物模型的建立和疾病的靶向基因治療等應用提供了非常大的前景。

　　此外，楊輝研究組還與熊志奇研究組，神經所蘇州非人靈長類研究平臺孫強團隊合作，通過將多個針對基因外顯子的連續指導RNA（sgRNA）注射到受精卵中，可以高通量制作各種基因完全敲除小鼠并用于表型分析，并快速制作基因敲除猴模型。

　　CRISPR/Cas9系統是一種非常高效的基因編輯方法，但是大部分被基因編輯過的動物都有嵌合性，也就是說它們只有一部分細胞的基因發生了編輯。對于涉及表型的研究而言，嵌合的基因編輯動物需要進一步地雜交育種，才能得到完全的基因敲除動物。當涉及大型動物，比方說非人靈長類時，嵌合體的問題就會顯得尤為嚴重，因為獼猴的繁殖周期長達5-6年而且每胎只生一個幼崽。之前有許多研究者都試圖一步法來產生沒有嵌合的基因修飾動物，尤其是大型動物。包括將Cas9 mRNA和sgRNA注射到卵母細胞中而非受精卵中，或注射Cas9蛋白，或注射雙sgRNA。但是DNA測序分析了這些方法的動物個體組織后，發現這些方法完全做到雙等位基因敲除的效率相當低。

　　這項研究中，研究人員發現向受精卵當中注射Cas9 mRNA和多個sgRNA的雞尾酒式混合物，單個或多個基因在小鼠胚胎能做到100%的完全刪除，以及猴子胚胎中91%-100%的刪除。這種方法能同時產生插入缺失和外顯子刪除，從而實現高效的基因完全敲除。研究者還應用C-CRISPR法建立基因功能完全敲除的F0代小鼠，用于基因功能的快速表型分析，以及獲得基因功能完全敲除的F0代猴。最后，通過高通量測序分析顯示，C-CRISPR在基因編輯過的小鼠和猴子中不會引入明顯的脫靶改變。