串聯質譜及液質聯用技術在藥物分析研究中的應用

近年來,隨著質譜技術以及聯用接口技術特別是包括電噴霧電離和大氣壓化學電離在內的大氣壓電離接口技術的突破,串聯質譜及液質聯用技術在藥物及其代謝物的定量和定性研究中發揮了極其重要的作用。對于藥物的定量研究而言,常用的質譜為串聯四極桿質譜,利用其多級離子選擇的特殊性質,在多級離子選擇監測掃描方式下,在保證質譜高靈敏度的同時,能極大的提高分析方法的特異性,減少或消除樣品中無關物質的干擾,使得痕量分析和鑒定成為可能。并簡化了生物樣品的制備和分離過程,大大加速樣品分析速度,特別適合對分析速度要求較高的藥物篩選和臨床試驗生物樣品的測定。在藥物及其代謝物的定性研究中,液質聯用系統中常用的質譜包括串聯四極桿、離子阱、四極桿-飛行時間質譜等。這些質譜各有特點,結合同位素標記等技術,在藥物代謝產物的分離鑒定、體內代謝途徑確定等方面起到了別的分析技術無法替代的作用[1]。

由于串聯質譜及液質聯用技術的優越性,目前已廣泛應用于藥代動力學和藥物代謝研究中。本文將重點介紹近年來色譜質譜聯用技術在藥代動力學和藥物代謝研究中的應用。1　串聯質譜技術在現代藥代動力學研究中的應用1.1　在現代藥代動力學研究中的作用　當今新藥的研制和開發要求藥代動力學研究向高通量和痕量檢測的方向發展,串聯質譜以其技術上的卓越性能在今天的藥代動力學研究中發揮著重要的作用,推動了藥代動力學研究的發展。

1.1.1　極大提高了分析方法的靈敏度

利用LC -MS 法成功建立了Beagle 犬血漿中人參皂苷20(R )-Rh 2的定量方法,并進行了藥代動力學研究,結果測得20(R)-Rh 2在Beagle 犬血漿中最低定量限為015ng Πm L ,20(R )-Rh 2在015~200ng Πm L 濃度范圍內線性關系良好(r 2=019998)。

1.1.2　提高了分析方法的特異性和選擇性　傳統的分析方法缺點之一在于檢測的特異性差,選擇性差。通過串聯質譜的分子離子和其特征碎片離子的質譜色譜圖能分別進行定量,且定量的結果十分可靠。王洪允等以LC -MS ΠMS 同時測定了血漿中奧馬曲拉及其中代謝物以及5中同位素內標,共10種化合物[3]

1.1.3　實現藥代動力學研究的高通量化,提高工作效率　在進行臨床藥代動力學研究時,經常需要在規定的時間內完成大批量生物樣品的制備和分析。由于串聯質譜固有的高靈敏度和特異性,能從復雜的生物基質中選擇性地測定目標待測物,因此大大簡化了樣品制備和分離過程。另外,串聯質譜對許多新技術表現出的兼容性,使得串聯質譜在PK 研究的高通量化上表現出了極大的應用價值。這些技術包括在線固相萃取、柱切換技術和混合功能離子檢測技術等。1.2　在藥代動力學研究中的定量分析及應用1.2.1　LC -MS ΠMS 方法建立的基本流程　建立用于體內藥物定量分析的LC -MS ΠMS 方法時,首先應該了解藥物在生物基質中的特點。人體(或動物)在接受藥物后,藥物經吸收、分布、代謝(生物轉化)、排泄等過程后,在體液中有濃度低,代謝復雜且代謝產物多等特點。因此,建立體內藥物的定量方法時,其基本流程為()優化質譜參數建立合適的質譜條件以提高檢測的靈敏度和特異性;(2)優化色譜系統建立最優化的色譜系統以實現更有效的分離;(3)優化樣品制備方法以從復雜的生物基質中有效提純藥物。

1.2.2　LC-MSΠMS方法在藥代動力學研究的應用　王寶蓮[4]等采用高效液相色譜串聯線性離子阱質譜同時檢測五味子提取物中四種主要成分,采用電噴霧離子源,多反應監測模式進行檢測。結果血漿樣品經甲醇沉淀、高速離心后進行分析,各成分在0101~210μgΠm L的濃度范圍內線性關系良好,最低定量限為0101~ 0102μgΠm L,建立了專屬性強、快速、靈敏、可靠,可滿足五味子提取物中四種主要成分藥代動力學研究要求的LC-MSΠMS方法。趙建波等[5]利用高效液相色譜-質譜檢測方法,研究秋水仙堿片的人體藥動學。血漿樣品011m L,經乙醚-二氯甲烷萃取,以ZOR BAX Ex2 tend-C18為色譜柱,流動相為甲醇-10mm olΠL乙酸銨,流速為111m LΠm in;采用質譜電噴霧離子化法,正離子多重反應檢測(MRM)。結果秋水仙堿濃度在0105~10μgΠL范圍內線性關系良好;平均回收率分別為(92147±1173)%;日內RS D≤2199%,日間RS D≤2122%,建立了適用于人血漿秋水仙堿濃度的測定及其藥代動力學研究的簡便、快速、準確可靠的液質聯用方法。楊潤濤等[6]建立同時測定大鼠血漿中白藜蘆醇苷及其代謝產物白藜蘆醇的液相色譜-串聯質譜方法。以Lichrospher C18色譜柱為分析柱,乙腈-水為流動相,采用電噴霧離子源(ESI),以多反應監測(MRM)模式檢測,內標法定量,用于定量分析的離子反應分別為mΠz389Π227(白藜蘆醇苷)和mΠz227Π143 (白藜蘆醇)。在選定的樣品預處理、色譜及質譜條件下,白藜蘆醇苷、白藜蘆醇及內標物能夠達到基線分離而且離子化效果好。用LCΠMSΠMS法檢測大鼠血漿中的白藜蘆醇苷及其代謝產物白藜蘆醇,線性范圍014 ~200μgΠL。

2　聯質譜技術在藥物代謝研究中的應用

2.1　確證代謝物結構的基本步驟　藥物在體內經過生物轉化,形成的多數代謝產物保留了原藥分子的基本骨架和部分亞結構,因此,代謝產物與原藥可能具有相似的裂解規律,丟失一些相同的中性碎片或產生一些類似的特征離子。用串聯質譜對原藥和代謝物分別進行目離子掃描、子離子掃描和中性丟失掃描,即可迅速找到可能的代謝產物,并推導出大致結構。常雁等[7]總結了利用MSΠMS鑒定藥物代謝物的方法,主要包括以下幾個步驟:①測定原藥的質譜;②測定原藥的子離子譜,選擇質子化分子離子、加合離子和主要的碎片離子進行裂解;③選擇原藥的主要中性丟失測定生物樣品的中性丟失譜。圖譜中的離子即為原藥和可能的代謝物的分子離子;④選擇主要的子離子測定生物樣品的母離子譜,所得母離子即為各個代謝物;⑤測定生物樣品中所有可能代謝物的子離子譜,解譜得到代謝物的結構;⑥測定代謝物的子離子譜,選擇任一新出現的中性丟失和子離子重復進行步驟3,4。

2.2　在藥物代謝產物結構確證中的應用　趙宇峰等[8]采用人腸內細菌和烏頭堿體外溫孵的方法,探討烏頭堿的代謝產物16-O-去甲基去氧烏頭堿在人腸內的生物轉化。利用離子阱電噴霧串聯質譜(ESI MSΠMSn)方法直接分析16-O-去甲基去氧烏頭堿的代謝產物。烏頭類生物堿在ESI正離子模式條件下形成質子化分子[M+H]+。結果成功檢測并鑒定了16-O-去甲基去氧烏頭堿被人腸內細菌轉化,通過脫乙酰基、脫苯甲酰基、脫甲基、脫羥基以及酯化反應產生新型的單酯型、雙酯型和脂類生物堿等10余種代謝產物。馬海英等[9]用電噴霧質譜(E SI-MS)法檢測觀察大鼠腸內菌離體對黃山藥總皂苷(TS DP)的代謝及整體給予TS DP后吸收入血成分鑒定。結果顯示TS DP容易被大鼠消化道菌群代謝,隨著代謝時間的延長,出現了各種甾體皂苷的降解產物及終產物薯蕷皂苷元(D io)。趙宇峰等[10]利用離子阱和傅立葉變換離子回旋共振電噴霧串聯質譜方法對牛蒡苷元和人腸內細菌真桿菌體外溫孵樣品進行測定,探討牛蒡苷元的生物轉化機理。木脂素類化合物在ESI負離子模式條件下形成準分子離子[M-H]-,在真桿菌的作用下,牛蒡苷元經過3次脫甲基反應最終生成4′,4″-二羥基腸內酯。

3　展望

串聯質譜及液質聯用技術結合了色譜、質譜兩者的優點,將色譜的高分離性能和質譜的高鑒別特點相結合,組成了較完美的現代分析技術,近年來在生物醫學、藥學、環境檢測、毒物分析等領域發揮了巨大作用。且隨著現代化高新技術的不斷發展及液相色譜-質譜聯用技術自身的優點,液相色譜-質譜聯用技術必將在未來幾年不斷發展且在藥物分析中發揮越來越重要的作用。