臨床質譜LCMS／MS檢測方法的開發和驗證

近年來，質譜技術取得了快速的發展，除了在食品檢測、環境監測、藥物開發、法醫毒理等領域得到廣泛應用外，其在生命科學和臨床檢測中的應用也越來越廣泛和深入，如維生素D和激素的檢測、新生兒遺傳代謝疾病篩查、治療藥物監測、細菌鑒定、蛋白組學、代謝組學等。與傳統分析手段相比，質譜技術具有靈敏度高、特異性強、準確度高的優點。目前，臨床上應用較廣泛的是液相色譜串聯質譜LC-MS/MS，該技術可以分析的化合物范圍廣（極性和非極性），且可以同時檢測多個目標化合物，能夠獲取豐富的化合物結構信息，定性和定量功能強大。

在使用LC-MS/MS開展臨床質譜檢測前，首先需要根據具體的分析對象開發相應的檢測方法，并對方法進行驗證，只有通過了性能驗證后方可開展檢測任務。由于臨床檢測的對象多為生物樣本（如全血、血清、血漿、尿液、唾液、膽汁、組織等），因此要建立適合臨床應用的質譜檢測方法，首先要從生物樣品的特性著手，結合質譜技術的特點，進行綜合的研究和分析。下面就臨床質譜檢測方法的開發和性能驗證做一介紹。LC-MS/MS檢測方法的開發和驗證大體分為五個步驟。

步驟一：文獻搜集和查閱

搜集相關的文獻資料，查閱相關的檢測方法，根據已有的方法結合本實驗室條件選擇相應的檢測方法，具體考慮以下各個要素：

• 目標化合物的理化性質（結構式、分子量、沸點、酸堿性、極性強度）

• 目標化合物在臨床上的意義（對檢測方法和處理方式有哪些要求）

• 采集生物樣本的類型（全血、血清、血漿、尿液、唾液、膽汁、組織等）

• 生物樣本的采集方法和采集量（如隨機尿、24h尿、晨尿，靜脈血、足底血、指尖血）

• 樣本處理、儲存和運輸方式（離心、靜置、避光、冷藏、冷凍）

• 目標化合物在樣品中的存在形式和預期濃度（游離態、結合態、有無類似物和代謝產物；常量級、微量級）

• LC-MS/MS法相對現有的其他方法優勢（是否有必要選擇LC-MS/MS法）

• LC-MS/MS法需要具備的儀器設備條件以及標準品、試劑、耗材等

• 樣本的采集、處理、保存、運輸以及檢測等整個過程需要花費的時間、精力和成本

• 質譜方法（離子化方式、離子掃描方式、離子通道和相應的參數）

• 液相色譜方法（色譜柱選擇、流動相組成和比例選擇、洗脫方式和進樣量）

步驟二：質譜方法建立和優化

• 配制標準物質溶液，直接引入質譜檢測器進行質譜掃描，獲取目標化合物的離子信息（可選擇ESI、APCI、APPI等離子化方式和正負離子模式）

• 臨床LC-MS/MS多為定量檢測，常采用多反應監測MRM和選擇性反應監測SRM模式選擇定量離子對和定性離子對（滿足靈敏度和特異性的條件下選擇響應高、選擇性和穩定性好的兩對離子對作為定性和定量離子對）

• 優化質譜離子源參數和掃描參數使所選離子對信號最強

步驟三：液相方法建立和優化

• 色譜柱的選擇(色譜柱填料的選擇如弱極性的C18、C8、C4、苯基柱等和極性固定相的氨基柱、氰基柱、硅膠柱等；色譜柱耐壓范圍和pH適用范圍)

• 流動相的選擇（如甲醇、乙腈和水等）及純度要求（超純水、色譜級、質譜級等）

• 流動相添加劑的選擇和加入量（揮發性的甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨等，盡量不加硫酸鹽、磷酸鹽等不揮發鹽，以免影響離子化效率和儀器損壞）

• 洗脫方式（等度洗脫、梯度洗脫以及其起始比例選擇）、進樣量、柱溫、運行時間等

• 將待測物的純物質經液相色譜保留和分離，優化色譜流動相比例、流速、改良劑加入量或改變色譜柱類型以便目標化合物得到較高的分離度，降低基質干擾，提高目標物響應強度

步驟四：樣品前處理方法建立和優化

生物樣品基質復雜，且待測目標物多為內源性的化合物，因此為了降低基質干擾、延長色譜柱使用壽命、防止系統堵塞損壞、提高檢測靈敏度和特異性，往往需要對樣品進行沉淀、萃取、凈化、富集等前處理。可根據目標物的特性和樣品的類型來選擇合適的前處理方法。

• 樣品的沉淀（蛋白沉淀，選擇合適的蛋白沉淀劑如乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇、酸等）

• 萃取、凈化和富集（液液萃取、液固萃取、固相萃取、超濾等；旋轉蒸發、氮氣吹掃等），極性較小的化合物可采用液液萃取的方法進行萃取，酸性、堿性以及其它極性較強的化合物大多需要經過固相萃取進行凈化和富集

• 樣品的衍生化（目標物響應信號差或極性太強等可采用衍生化法）

• 樣品的復溶（最好以初始流動相為復溶液對目標物進行復容）

• 自動化樣品前處理系統（樣本量大，資金允許的實驗室可考慮引進自動化前處理系統如在線固相萃取系統Online SPE，但仍需考慮系統配備后的方法開發難度、設備維護、操作人員培訓等諸多因素）

步驟五：方法學性能驗證

LC-MS/MS臨床檢測方法建立之后，在用于臨床檢驗之前，必須對新建方法進行全面、嚴格的性能驗證，確保檢測方法準確性高、可靠性強、重復性好，能夠為臨床診斷提供合格的數據。

• 精密度實驗（批內和批間精密度，考察方法的穩定性和重現性）

• 回收率實驗

• 最低檢測限(LLOD)和定量限（LLOQ）以及檢測線性范圍，方法靈敏度是否能夠滿足臨床檢測需求以及臨床可報告范圍

• 基質效應、干擾試驗、攜帶效應

• 生物樣品穩定性、前處理后樣品穩定性

• 質控品驗證，檢測方法準確度

• 方法參考值的建立與驗證等

方法通過性能驗證之后，還需要對同一實驗室不同操作人員因操作習慣和操作方式不同引起的結果差異性進行比對和考察評估。此外，在日常的臨床檢驗過程中還需要長期觀察和監測分析方法的穩定性，如目標分析物和內標物的信號響應強度、保留時間、峰形有無變化，定量和定性離子對的比值變化等，同時需要采用完善的質量控制措施，包括室內質控、室間質評等質量保證措施，確保檢測結果的準確性和可靠性。