（1）取第一鏈反應液20uL，再依次加入：
10X第二鏈緩沖液20uL
DNA聚合酶123ul。
RNaseH0.8ul
H2O加至終體積為100/uL
（2）輕輕混勻，如需進行第二鏈同位素摻入放射性活性測定，可取出10uL至另一eppendorf管，加入2～5uLCi[α一32P]dCTP。
（3）14℃溫浴2h（如需合成長于3kb的cDNA，則需延長至3～4h）。
（4）摻入測定eppendorf管中加入90ul 50mM EDTA，取10ul進行同位素摻入放射性測定．余下的可進行電泳分析。
（5）將cDNA第二鏈合成的反應液70℃處理10min，低速離心后置于冰上。
（6）加入2uL T4 DNA聚合酶，37℃溫育10min。
（7）加入10uL 200mmol/L EDTA終止反應。
（8）用等體積苯酚：氯仿抽提cDNA反應液，離心2min。
（9）水相移至另一eppendorf管，加入0.5倍體積的7.5mol/L醋酸銨（或0.1倍體積的1.5mol/L醋酸鈉，pH5.2），混勻后再加入2.5倍體積的冰冷乙醇（-20℃），-20℃放置30min后離心5min。
（10）小心丟去上清液，加入0.5mL冰冷的70%乙醇，離心2min。
（11）小心移去上清液，干燥沉淀。
（12）沉淀溶于10～20ul TE緩沖液。