簡介
阿爾茨海默病（AD）是典型的老年性癡呆，腦組織內淀粉樣蛋白β（Aβ）的累積是造成此病的主要原因，與此同時，患有AD的患者其累積的Aβ90%在腦血管壁上發現。眾所周知，Aβ是由可分解出兩種蛋白（β-和γ-分泌）的淀粉樣前體蛋白（APP）產生的，累積在腦組織內的Aβ分子主要是由神經細胞內的APP表達產生，即APP695.與此相反，另一不同APP即APP770，表達于腦血管內皮細胞，最新報道稱，APP770產生的Aβ也在腦血管壁上累積
此ELISA試劑盒用于EDTA-血漿，腦脊髓液和上清中人APP770的檢測
實驗原理
此試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒，使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑，最終溶液所顯示的顏色強度與樣品中APP770的量成正比
檢測范圍
0.10~6.2ng/mL
預期用途
僅用于研究，不能用于診斷
此試劑盒用于EDTA-血漿腦脊液和細胞上清中人APP770的定量檢測
試劑盒組成
1. 微孔板，96T，包被有抗人APP OX2(351)兔子IgG抗體，親和純化
2. 標記抗體濃縮，30X，0.4ml，HRP標記的抗人APP（R101A4）小鼠IgG 單抗Fab片段
3. 標準品，0.5ml，2支，重組人APP770
4. EIA緩沖液，30ml，1%的BSA，含0.05%的吐溫20的PBS
5. 標記抗體稀釋液，12ml，1%的BSA，含0.05%的吐溫20的PBS
6. 著色劑，TMB，15ml
7. 終止液，1N硫酸，12ml
8. 洗滌緩沖濃縮液，40X，50ml，0.005%吐溫20的磷酸緩沖液
準備步驟
試驗所需材料但試劑盒未提供
l 酶標儀（450nm）
l 帶刻度的量筒與燒杯
l 孵箱（37℃±1℃）
l 吸水紙
l 稀釋試管
l 微量移液器和取樣吸頭
l 去離子水
l 坐標紙（log/log）
l 用于稀釋標準品的試管
l 洗滌瓶
試劑準備
1. 洗滌緩沖液制備：先將洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得。配制的洗滌液應保存于冰箱內，并于2周內用完
2. 標記抗體的制備：用標記抗體稀釋液將標記抗體稀釋30倍，即得。
例：如果只測一條板，8孔，則需要標記抗體800ul（30ul的標記抗體+870ul的標記抗體稀釋液，混勻，使用時每孔加100ul）
此步驟在實驗開始前完成
剩余的標記抗體濃縮應裝于密封瓶內，保存在4℃
3. 標準品的制備：吸取0.5ml的去離子水至標準品瓶內，充分混勻，得到12.4ng/ml的人APP770標準品
4. 標準品的稀釋：準備8個試管用于標準品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液
每管的濃度如下
1號管 6.2ng/ml
2號管 3.1ng/ml
3號管 1.55ng/ml
4號管 0.78ng/ml
5號管 0.39ng/ml
6號管 0.19ng/ml
7號管 0.10ng/ml
8號管 0ng/ml（試驗樣品空白）
吸取230ul的標準品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次連續稀釋，標準品范圍為6.2~0.10ng/ml
5. 樣品稀釋：樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒有評估，我們建議，先用幾個不同稀釋比例的樣品進行檢測，來確定樣品最佳稀釋比例
實驗步驟
使用前，所有樣品應平衡至室溫，大約30min，然后充分混勻，確保試劑質量無變化，標準曲線和樣品檢測同時進行
試劑 | 檢測樣品 | 標準品 | 檢測樣品對照孔 | 試劑對照孔 |
檢測樣品100ul | 稀釋標準品（1-7管）100ul | EIA緩沖液（第8管） 100ul | EIA緩沖液100ul | |
蓋板，4℃下溫育過夜 | ||||
洗板7次 | ||||
酶標抗體 | 100ul | 100ul | 100ul | - |
蓋板，37℃下溫育30min | ||||
洗板9次 | ||||
顯色劑 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
室溫避光溫育30min | ||||
終止液 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
加終止液后30min內450nm處讀取OD值 |
1） 確定好空白對照孔，并在相應的微孔中加入100ul EIA緩沖液。
2） 確定好樣品對照孔，檢測樣品孔和標準品孔，然后分別將100ul樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標準品加入到相應的微孔中。
3） 蓋板，4℃下溫育過夜
4） 用洗滌瓶洗板，在微孔中加入洗滌液浸泡15-30秒，棄去洗滌液。重復7次，最后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機洗板時，用洗板機洗四次后，再用洗滌瓶洗3次。
5） 每孔加100ul酶標抗體，除試劑空白對照孔外
6） 蓋板，37℃下溫育30min
7） 按照步驟4）洗板9次
8） 將所需量的顯色劑加入到試管中，然后在每一微孔中加入100ul顯色劑。為了避免污染，請勿將剩余試劑在倒入原裝試劑瓶中。
9） 室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色
10）在每孔加100ul終止液，此時溶液顏色會變成黃色
11）擦去微孔板底部的污點或水滴，終止液加入后30min內，在酶標儀450nm處讀數
特別注意
1. 試驗樣品采集后應立即檢測或是凍存，凍存的樣品避免反復凍融，檢測前應在低溫下先將其完全溶解混勻
2. 試驗樣品用EIA緩沖液稀釋
3. 試驗樣品和標準品應做雙份檢測
4. 試驗樣品應在中性PH范圍，有機溶劑的污染可能會影響檢測
5. 只能用試劑盒提供的洗滌液洗板，否則會導致試驗失敗
6. 吸水紙上拍干微孔板，不能擦拭
7. TMB底物液應貯存于黑暗處，因其對光敏感，且避免接觸金屬
8. 加入終止液后30min內必須酶標儀讀數
結果計算
繪制曲線前，所有的數據都應減去試驗樣品空白值，包括標準品和未知的樣品。以標準品的OD值和濃度在對數-對數坐標紙上繪制標準曲線，從標準曲線上可直接讀取未知樣品的濃度
附：采用全自動酶標儀檢測，只需檢測前設置好酶標儀的相關參數，如坐標參數（線性，半對數）和計算方式參數（三次回歸、四參數或雙對數曲線方程），即可直接得到結果
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。