人溶菌酶的藥理作用及在畢赤酵母表達系統中的表達研究

人溶菌酶是一種重要的非特異性體液免疫因子，對于人體而言是不可或缺的，藥理研究表明其具有抗菌消炎、抗病毒和增強免疫力等功能。人溶菌酶在人體內分布雖然廣，然而難以獲取，因此人溶菌酶的廣泛應用只能寄希望于采用DNA重組技術，利用酵母表達或真核表達系統進行大規模生產人溶菌酶。

人溶菌酶是人體本來就存在的一種蛋白質，作為藥物使用不會對人體產生任何不良反應和副作用，即使長期使用也不會產生耐藥性，一些生物公司提供的蛋白表達服務可以高效表達人溶菌酶。畢赤酵母表達系統是一種能夠高效表達重組蛋白的系統，一方面由于畢赤酵母屬于真核生物，因此畢赤酵母表達出來的蛋白可以進行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達的蛋白分泌到培養基中，方便蛋白純化。隨著人溶菌酶研究的深入，相信終有一天會開發出具有重要臨床價值的藥物。

1、人溶菌酶的藥理作用

（1）抗菌消炎

眾所周知，肽聚糖是革蘭氏陽性菌細胞壁的一種重要成分。人溶菌酶可水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺中的B-1,4糖苷鍵，在滲透壓作用下導致革蘭氏陽性菌細胞壁破裂，發生溶菌作用。在體內環境下，由于有分泌型免疫球蛋白A、補體參與，人溶菌酶還能水解某些革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌等。由于真菌細胞壁中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺之間形成的B-1,4糖苷鍵(幾丁質)也是人溶菌酶作用的底物，所以人溶菌酶可以抗含有幾丁質細胞壁的真菌感染。人溶菌酶還能與各種誘發炎癥的酸性物質結合，使其失活，并增強抗生素和其他藥物的療效，改善組織基質的粘多糖代謝，從而有利于修復被炎癥損傷的組織。

（2）抗病毒

人溶菌酶是一種堿性蛋白質，在體內近于中性的pH環境下帶有大量正電荷，可與帶負電荷的病毒蛋白起作用，和DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使侵入體內的病毒失活。

（3）增強免疫力

溶菌酶參與機體內多種免疫反應，在機體正常防御和非特異性免疫中具有重要作用。它可改善和增強巨噬細胞吞噬消化功能，降低細胞抑制劑導致的白細胞減少，結合細菌脂多糖，減輕內毒素作用，以達到增強機體抵抗力的目的。

（4）激活血小板

人溶菌酶能激活血小板，改善組織局部循環障礙，分解膿液，增強局部防衛，從而更好地體現抗菌、消炎、止疼等作用。

2、人溶菌酶在畢赤酵母表達系統的表達研究

(1)將α信號肽和人溶菌酶（hLYZ）基因作為整體進行密碼子優化，并將其插入pPICZαA空載體，構建重組表達載體pPICZ-OptαF+hLYZ。通過轉化篩選，獲得一株穩定性較好的重

在5 L發酵罐中培養K1，細胞密度達到50 g-DCW?L-1開始誘導，甲醇濃度控制于5 g?L-1，最終的總蛋白濃度為1.71 g?L-1，總酶活達到262,152 U?mL-1。

(2)對α信號肽做了進一步的優化處理，新插入39個堿基，構成包含增長的信號肽和人溶菌酶（hLYZ）基因的新序列將其插入pPICZαA空載體，構建得到另一表達載體pPICZ-EhnαF+hLYZ，通過轉化篩選獲得重組子K4。K4搖瓶表達發酵液總蛋白濃度為320 mg?L-1，總酶活為16,974 U?mL-1，均優于K1。在5 L發酵罐中采用與K1相同的誘導策略，最終發酵液中的總蛋白濃度可達到2.54 g?L-1，比K1提高48.5%，但總酶活為258,712 U?mL-1，比 K1 略低。

(3)考察了 K4在高細胞密度(～100 g-DCW?L-1)下起始誘導的hLYZ表達性能。進行純甲醇誘導，并將甲醇濃度控制于5 g?L-1，誘導54 h發酵液中的總蛋白濃度為3.02 g?L-1，但隨后發生嚴重降解，誘導68 h后僅剩2.07 g?L-1。采用甲醇/山梨醇共混流加策略，優先將甲醇濃度控制于5 g?L-1，不控制溶解氧濃度，誘導68 h總蛋白濃度可達到2.88 g?L-1，未出現明顯的蛋白降解現象。上述二種誘導策略下最高的總酶活水平分別為324,072 U?mL-1 和 290,438 U?mL-1。

(4)利用Bgl Ⅱ和BamH Ⅰ屬于同尾酶的特點，設計多拷貝串聯hLYZ基因表達載體，并獲得了兩拷貝及四拷貝串聯hLYZ基因轉化重組子K-2-2、K-4-2。搖瓶發酵條件下，K-2-2和K-4-2的最高總蛋白濃度分別為193.0mg?L-1和185.3 mg?L-1，對應的總酶活分別為5,256 U?mL-1和5,424 U?mL-1。5 L發酵罐中，K-2-2低細胞密度(～50 g-DCW?L-1)誘導73 h及高細胞密度(～100 g-DCW?L-1)誘導65 h后，發酵液中的總蛋白濃度分別為0.79 g?L-1和0.93 g?L-1，總酶活分別為70,332 U?mL-1和71,529 U?mL-1，約為重組子K1的50%。K-4-2誘導表達10 h后細胞失去活性，發酵失敗。多拷貝串聯hLYZ基因轉化重組子的溶菌酶表達性能較低。

目前重組人溶菌酶的大規模生產還存在這樣或那樣的問題，但重組DNA技術發展日新月異，相信在不久的將來，會有高效表達的工程菌或工程細胞問世。美迪西生物醫藥在重組蛋白表達與純化服務方面經驗豐富，其擁有多種蛋白表達系統，包括原核蛋白表達系統、酵母蛋白表達系統、昆蟲細胞蛋白表達系統（桿狀病毒）哺乳動物細胞蛋白表達系統，具備多種融合技術，可以為客戶在蛋白表達與純化方面提供多種選擇。從方案設計、基因優化、表達條件優化到純化的技術體系，以提高客戶的目的蛋白表達水平。