1 概述
聚乙二醇(polyethylene,PEG)是一類由環氧乙烷聚合而成的化合物,具有一定分子量分布與親水性特點,呈線性、分支型及其他特殊類型的分子形態。人用聚乙二醇化重組蛋白及多肽制品是通過聚乙二醇端基的活性基團與重組蛋白或多肽的氨基酸側鏈基團、N端/C端的氨基或羧基發生共價反應,修飾而成的治療性藥物。
本總論規定了人用聚乙二醇化重組蛋白及多肽制品生產和質量控制的通用性技術要求,重點針對聚乙二醇修飾的重組蛋白產品。涉及重組蛋白的生產及質量控制,還應符合 “人用重組DNA蛋白制品總論” 及本版藥典相關各論的具體要求。
2 制造
2.1 基本要求
人用聚乙二醇化重組蛋白及多肽制品具有復雜的質量屬性,應在充分了解臨床應用目的的基礎上確定制品的關鍵質量屬性,以“質量源于設計”“風險評估”的原則和理念,確定相應的修飾策略、生產工藝、質量控制策略,并通過建立有效的“質量管理體系”保證制品的安全性和有效性。人用聚乙二醇化重組蛋白及多肽制品的制造主要包括重組蛋白和多肽的制備、聚乙二醇修飾、修飾產物的分離和純化及制劑等過程。
生產過程中使用的原材料和輔料應符合本版藥典的相關要求。制備重組原型蛋白和多肽所需的工程細胞的來源、管理及檢定應符合“生物制品生產檢定用菌毒種管理及質量控制”和“生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及質量控制”的相關要求。生產質量管理應符合中國現行《藥品生產質量管理規范》的要求。
2.2 聚乙二醇
應選用適宜的聚乙二醇進行修飾,并明確聚乙二醇的活性基團種類、擬成鍵的鍵型、分子形態、分子量范圍等質量屬性,以確保批間一致性。
2.2.1 分子量及多分散性
可采用基質輔助激光解吸附飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)、凝膠滲透色譜-多角度激光散射(GPC-MALLS)檢測器或凝膠滲透色譜-示差檢測器(GPC-RID)等方法測定聚乙二醇的重均/數均分子量及多分散性。
2.2.2 端基取代率
聚乙二醇的分子末端需經活性基團取代后方可與蛋白質和多肽上的反應基團發生修飾,可采用核磁共振(NMR)或液相色譜柱前衍生法進行測定。
2.2.3 雜質檢測
應對聚乙二醇中可能存在的雙醇、斷裂與非活化聚乙二醇等特定雜質及其他需要控制的相關雜質進行分析及限量控制。
2.3 重組原型蛋白及多肽
應按照“人用重組DNA蛋白制品總論”和相關各論的要求,對重組原型蛋白的理化特性、生物學活性、免疫化學特性等質量屬性以及工藝與產品相關雜質進行控制。應盡可能明確重組原型蛋白和多肽的活性中心、配體或底物結合中心所涉及的氨基酸,抗原表位的結構特點與關鍵氨基酸序列,以及可能發生修飾的氨基酸在重組原型蛋白表面的分布情況。
2.4 生產過程的控制
2.4.1 重組原型蛋白的制備
應符合“人用重組DNA蛋白制品總論”和相關各論的要求。
2.4.2 聚乙二醇修飾及偶聯工藝
聚乙二醇修飾方式包括定點修飾、單位點隨機修飾或多位點隨機修飾等方式。修飾及偶聯工藝的選擇應設定適宜的反應條件,以降低重組原型蛋白和多肽藥物的活性損失及可能的修飾副產物。應設定關鍵工藝參數的可接受限值范圍,包括聚乙二醇的加入方式、聚乙二醇與蛋白質或多肽的投料比、緩沖液的組成及酸堿度、反應條件等。應建立適宜的工藝過程控制,以保證偶聯反應的批間一致性。
2.4.3 修飾蛋白的提取和純化
根據修飾產物的理化特性確定分離、純化和反應條件。如可依據修飾產物電荷的變化或分子量的變化選擇相應的分離純化手段,工藝參數建立的目標為盡可能獲得組分一致的修飾產物。
2.4.4 修飾蛋白原液
純化后的修飾產物分裝于貯存容器中即為原液。如需加入穩定劑或賦形劑,應不影響質量檢定,否則應在添加輔料前取樣進行原液檢定。應采用適宜方法對原液質量進行檢測,必要時應與參比品進行比較。原液的含量測定方法與成品制劑的含量測定方法顯著不同時,應考慮方法之間的測定誤差,避免因此引發的原液投料偏差。
2.4.5 半成品
除另有規定外,如需對原液進行稀釋或加入其他輔料制成半成品,應在制備成品前確定半成品的質量控制要求,包括檢定項目和可接受的標準。
2.4.6 成品
應符合本版藥典相關通則的要求。
3 質量控制
人用聚乙二醇化重組蛋白及多肽制品的質量控制與修飾蛋白和多肽的分子大小、修飾位點與修飾程度、結構特征、質量屬性復雜程度以及生產工藝相關。質量控制體系主要包括原輔材料的質量控制、生產工藝的過程控制以及產品檢定等。質量控制策略應基于對關鍵原料的質量評價、對終產品關鍵質量屬性的理解和積累,結合風險評估手段而綜合制定。納入質量標準的檢定項目、可接受標準限度,應結合來自代表工藝的多批樣品的數據、用于證明生產批次間一致性的數據、臨床末期工藝放大后的驗證數據、穩定性研究數據等綜合確定。
3.1 特性分析
采用適宜的、先進的分析技術手段,從理化(分子大小與分子量分布、等電點、氨基酸組成、修飾情況、空間構象等)、免疫學、生物學特性,有關物質和雜質等方面對修飾產物進行嚴格的特性分析,作為原液及制品質量標準建立的基礎,以保證制品具有預期的構象、聚集和(或)降解狀態。特性分析至少應包括以下方面。
3.1.1 理化特性
3.1.1.1 修飾位點
對于單位點和多位點隨機修飾產物,應確定主要豐度的修飾位點和比例,并說明主要修飾位點是否位于活性中心內。必要時,應明確次要修飾位點及其含量,以保證工藝穩定和批間一致性。對于定點修飾的修飾產物,應確證目標修飾位點并規定其所占比例的限度要求。修飾位點的確定可通過直接比較修飾前后蛋白質的質量肽圖,也可采用適宜的色譜分離手段分離修飾物或異構體,再對其進行質量肽圖比對或氨基酸測序、質譜分析、實時成像毛細管等電聚焦電泳(cIEF-WCID)分析等。
3.1.1.2 平均修飾率
平均修飾率反映修飾效果,是指重組原型蛋白或多肽中已發生修飾的基團占全部可被修飾基團的百分比例,可通過準確測定修飾產物中聚乙二醇與蛋白質的含量,并經分子量換算摩爾比得到。可采用TNBS法/熒光胺法、液相色譜-多種檢測器聯用法、水解法等進行測定。
3.1.1.3 位點異構體
聚乙二醇隨機修飾的蛋白質,通常發生在賴氨酸側鏈以及N端α-氨基,可導致修飾產物的等電點發生改變。可采用離子交換色譜法等適宜方法對單位點隨機修飾產物的位點異構體進行分離并盡可能給出不同異構體的占比限度要求;應盡可能明確多位點隨機修飾產物的位點異構體。
3.1.1.4 聚乙二醇修飾數目的范圍及相對含量
對于多位點隨機修飾產物,應建立聚乙二醇修飾數目的控制方法,說明修飾數目的分布情況。可采用基質輔助激光解吸附飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)、分子排阻色譜(SEC)、離子交換色譜、變性SDS-PAGE法或其他適宜方法,對修飾數目的范圍及其相對含量進行控制。
3.1.1.5 分子量
分子量是聚乙二醇對重組原型蛋白是否正確修飾的標識,可采用MALDI-TOF-MS等方法測定制品的平均分子量。
3.1.1.6 等電點
修飾蛋白或多肽的等電點可能發生偏移,一定程度上可反映聚乙二醇的修飾程度。可采用水平薄板等電聚焦電泳、毛細管等電聚焦電泳或全柱成像毛細管等電聚焦電泳等方法確定修飾物的等電點范圍。對于分子量較大的修飾產物,可采用瓊脂糖為支持物的平板等電聚焦電泳,以避免空間位阻對遷移率的影響。
3.1.1.7 空間結構(高級結構)的一致性
可采用適宜的方法對修飾前后蛋白質和多肽的高級結構進行比較和分析,并評價一致性。
3.1.2 生物學活性
生物學活性應符合“人用重組DNA蛋白制品總論”的要求。修飾蛋白及多肽與重組原型蛋白及多肽在結構、生物學活性上均可能存在顯著不同,應根據產品特點,以及待測樣品與標準品量-效反應關系的差異,選擇適宜的修飾前/后生物學測定方法和活性參考品。
聚乙二醇化重組蛋白及多肽藥物的體內生物學活性測定,可在重組原型蛋白體內生物效價的評價方法基礎上,摸索修飾產物的血藥濃度-時間曲線,建立新的測定方法,必要時可重新定義效價單位。
對于酶的活性測定,應對修飾后的酶類制劑重新測定其特征反應動力學參數,即kcat值(催化常數)、Km值(米氏常數)與Vmax(最大反應速率)。
必要時應設定親和力和免疫反應性(包括與其他類似結構蛋白的交叉反應性)檢測項目,以及對目標分子中與相應表位作用部分的生物學鑒別。
3.1.3 雜質分析
應符合“人用重組DNA蛋白制品總論”“藥品雜質分析指導原則”“分析方法驗證指導原則”的相關要求。
3.1.3.1 高分子物質
應對修飾蛋白的聚合體,以及聚乙二醇自身高分子聚合物(diol-PEG)形成的高分子蛋白質進行控制。可采用體積排阻色譜法、反相色譜法或碘染色還原SDS-PAGE法進行高分子物質的檢查,應考察方法的靈敏度,并制備含有高聚物的系統適用性樣品或高分子對照品。
3.1.3.2 聚乙二醇和原型蛋白殘留量
聚乙二醇和原型蛋白殘留量的控制有助于保證修飾產物工藝的穩定性和產品的安全性,應根據臨床研究使用的最大劑量合理設定聚乙二醇和原型蛋白殘留量的限度值。可采用蒸發光檢測器等通用型檢測器對殘留聚乙二醇進行定量或限度分析,或采用凝膠色譜/反相色譜對原型蛋白中殘留物進行分析。建立方法時應考察方法的靈敏度。
3.1.4 蛋白質含量
應采用適宜的理化/免疫學方法及同質對照品,對修飾產物進行蛋白質含量測定。應排除聚乙二醇對Lowry法或考馬斯亮藍染色法等常規含量測定方法可能存在的干擾。
3.1.5 參比品
應符合“人用重組DNA蛋白制品總論”的相關要求。原則上應采用同質參考品,如采用原型蛋白等替代參考品,應對其適用性進行充分驗證。
3.2 制品檢定
應符合“人用重組DNA蛋白制品總論”的原則。
3.2.1 鑒別
根據制品特性,選擇理化、生物/免疫學方法,對修飾產物進行鑒別試驗。修飾位點研究中所建立的液相肽圖部分,可用于原液的鑒別檢查。應建立產品專屬的反相液相肽圖法,采用通則或原型蛋白相關各論的肽圖方法,應進行方法適用性驗證和實驗條件優化,使得通過比較修飾前后的肽圖,可直觀分析發生主要修飾的肽段。
3.2.2 聚乙二醇修飾程度
應設置平均修飾率、位點異構體的相對含量、聚乙二醇修飾個數的范圍及相對含量、修飾產物的分子量、等電點等檢查項對聚乙二醇修飾程度予以控制,此部分檢定項目可在原液階段進行控制。
3.2.3 有關物質和雜質
應采用適宜的方法對供試品氧化產物、脫酰胺產物、游離聚乙二醇、原型蛋白及多肽或其他結構不完整的分子進行定量分析,并對宿主蛋白、DNA及其他工藝雜質如修飾試劑、催化劑、有機溶劑等殘留物進行檢測。
3.2.4 效價
效價測定是以制品生物學特性相關屬性為基礎的生物學活性定量分析,原則上效價測定方法應盡可能反映或模擬其作用機制。比活性(每1mg蛋白質具有的生物學活性單位)對證明制品的一致性具有重要的價值。
3.2.5 含量
采用適宜方法和參考品作為對照,測定原液和成品的含量。
3.2.6 安全性試驗
涉及原液安全性的相關檢測項目應根據原液制備可能引入的安全性風險而定,通常包括微生物限度、細菌內毒素檢查等。成品的安全性檢測應至少包括無菌、細菌內毒素、異常毒性檢查等。
3.2.7 其他檢測項目
應根據相關制品的特性和劑型而定。檢測應包括但不限于外觀(例如性狀、顏色)、可見異物及不溶性微粒檢查,pH值、滲透壓摩爾濃度、裝量、裝量差異、穩定劑和水分測定等。
4 包裝及密閉容器系統
應對原液和成品與包裝材料的相容性進行檢測和確認,尤其應關注聚乙二醇與包裝材料(如預灌封注射器及丁基膠塞中硅油)之間的相互作用,考察制品的澄清度、有關物質和活性等穩定性指標,有助于控制由此帶來的產品潛在的安全性和有效性風險。此外,應采用適宜的方法對容器完整性進行檢測,防止容器泄漏導致產品無菌狀態的破壞。
5 保存、運輸及有效期
制品應符合“生物制品分包裝及貯運管理”的規定,在適宜的環境條件下貯存和運輸。自生產之日起,按批準的有效期執行。
6 標簽
標簽應符合“生物制品分包裝及貯運管理”要求和國家相關規定,標示內容至少應包括:
(1)每瓶或每1ml的活性單位(如必要);
(2)每瓶有效成分含量和(或)蛋白質含量;
(3)每瓶標示體積;
(4)凍干制劑復溶液體的名稱、體積及復溶后的使用期限;
(5)使用前進行適量稀釋(如果需要);
(6)有效期。