實驗目的:
1.熟悉分子生物學實驗的操作特點。
2.掌握人類基因組DNA提取的基本原理。
3.熟悉人類基因組DNA提取的基本方法。
4.熟悉瓊脂糖凝膠電泳的原理和操作。
實驗原理:
用細胞裂解液裂解細胞膜,收集細胞核,加入SDS破裂核膜,用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并從DNA上解離下來,經苯酚﹑氯仿抽提去除蛋白質,無水乙醇沉淀DNA,75%乙醇洗滌DNA沉淀,真空干燥后,溶解于TE中即得到高分子量的DNA。
本次實驗使用的試劑盒系直接加入裂解液裂解細胞后,用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并從DNA上解離下來,并使用RNaseA降解RNA,再利用特殊硅基質膜吸附DNA的特性,可快速、高效地純化回收基因DNA。
操作步驟:
細胞裂解與RNase/蛋白酶K 消化
1. 取100 μl抗凝全血置于1.5ml Eppendorf離心管中,再加入100 μl裂解液和20 μl RNaseA/蛋白酶K液,用移液器來回吹打混勻,室于55℃溫浴35分鐘,其間來回顛倒離心管幾次,直至溶液呈水溶狀。
2. 加入10μl 3M的NaAc(pH 4.8),隨后加入1250 μl結合緩沖液,充分振蕩混勻,12,000 rpm離心30秒。
DNA與吸附柱結合
3.用移液器Tip轉移上清并加入到離心吸附柱(套好收集管)中,放置1分鐘,12,000 rpm離心30秒,倒掉收集管中的廢液。
注意:待轉移上清約1300μl,離心吸附柱容量約650 μl,故需每次轉移上清650 μl到離心吸附柱中,離心,倒掉收集管中的廢液,重復實驗操作步驟3。
DNA的純化
4. 再加入600 μl洗滌緩沖液(washing buffer)到離心吸附柱(套好收集管)中,12,000 rpm 離心30秒。
5.重復步驟4一次,12,000 rpm 離心3分鐘以充分除去洗滌緩沖液。
6.小心取出離心吸附柱,棄收集管,將離心吸附柱套入一個干凈的1.5ml Eppendorf 離心管,并加入50 μl洗脫緩沖液(elution buffer) 到離心吸附柱中(洗脫緩沖液一定要加在離心吸附柱的正中),放置1分鐘,于12,000 rpm 離心30秒。
7.取出Eppendorf 離心管,其中便是所提取基因組DNA。
DNA的瓊脂糖凝膠電泳
8.取8 -10μl基因組DNA,并加入2 μl上樣緩沖液,混勻,加樣到1%瓊脂糖凝膠點樣孔中,電泳。