簡介 G-CSF屬于細胞因子類，刺激中性粒前體細胞的分化和增殖，它由成纖維細胞和血管內皮細胞產生，且有報道稱，在某些腫瘤內可刺激其增殖。人G-CSF試劑盒可檢測人G-CSF 原理 此試劑盒根據酶免法的夾心原理，利用兩種不同的高特異性抗體，TMB作為著色劑，顏色強度與人G-CSF的量成正比 檢測范圍 7.81~500pg/ml（37℃下第一次孵育1小時） 1.95~250pg/ml（4℃下第一次孵育過夜）：內部數據 預期用途 1. 此試劑盒用于細胞上清液中人G-CSF的定量檢測 2. 重組的和天然的G-CSF都可以用此試劑盒檢測 3. 經驗表明，由于全血的干擾，血清或EDTA血漿的稀釋比例較低可導致結果更低（見附錄一） 試劑盒組成 1. 包被板，96孔，包被有抗人G-CSF鼠IgG單抗，親和純化 2. 標記抗體濃縮，30X，0.4mlx1，HRP標記的抗人G-CSF兔IgG Fab’，親和純化 3. 標準品，1.0mlx2，重組人G-CSF 4. EIA緩沖液，30mlx1,1%BSA，含0.05%吐溫20的PBS 5. 標記抗體稀釋液，12mlx1,1%BSA，含0.05%吐溫20的PBS 6. 著色劑，15mlx1，TMB底物液 7. 終止液，12mlx1，1N硫酸 8. 洗滌緩沖濃縮液，50mlx1, 40X，含0.05%吐溫20的磷酸緩沖液 實驗所需材料但試劑盒未提供 1. 酶標儀（450nm） 2. 移液器和槍頭 3. 燒杯 4. 蒸餾水 5. 孵箱（37±1℃） 6. 坐標紙（對數-對數） 7. 吸水紙 8. 標準品稀釋管 9. 洗瓶 10. 一次性試驗管 準備 1. 洗滌緩沖液制備：先將洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得。配制的洗滌液應保存于冰箱內，并于2周內用完 2. 標記抗體的制備：用標記抗體稀釋液將標記抗體稀釋30倍，即得。 例：如果只測一條板，8孔，則需要標記抗體800ul（30ul的標記抗體+870ul的標記抗體稀釋液，混勻，使用時每孔加100ul） 此步驟在實驗前完成 剩余的標記抗體濃縮應裝于密封瓶內，保存在4℃ 3. 標準品的制備：吸取1.0ml的去離子水至標準品瓶內，充分混勻，得到1000pg/ml的人G-CSF標準品 4. 標準品的稀釋：準備8個試管用于標準品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液 每管的濃度如下 1號管 500pg/ml 2號管 250pg/ml 3號管 125pg/ml 4號管 62.5pg/ml 5號管 31.25pg/ml 6號管 15.63pg/ml 7號管 7.81pg/ml 8號管 0pg/ml（試驗樣品空白） 吸取230ul的標準品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次連續稀釋，標準品范圍為500~7.81ng/ml 
內部實驗步驟（4℃下孵育過夜） 高靈敏度所必須的操作步驟 1） 標準品的準備：吸取2.0ml的去離子水至標準品瓶內，充分混勻，得到500pg/ml的人G-CSF標準品 2） 標準品的稀釋：準備9個試管用于標準品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液 每管的濃度如下 1號管 250 pg/ml 2號管 125pg/ml 3號管 62.5pg/ml 4號管 31.25pg/ml 5號管 15.63pg/ml 6號管 7.81pg/ml 7號管 3.91pg/ml 8號管 1.95pg/ml 8號管 0pg/ml（試驗樣品空白） 吸取230ul的標準品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次連續稀釋，標準品范圍為250~1.95pg/ml,9號管為試驗樣品空白 5. 樣品稀釋：樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒有建立，我們建議，先用幾個不同稀釋比例的樣品進行檢測，來確定樣品最佳稀釋比例 實驗步驟 使用前，所有樣品應平衡至室溫，大約30min，然后充分混勻，確保試劑質量無變化，標準曲線和樣品檢測同時進行 如圖： 
1. Reagent Blank孔內加入100ul的EIA緩沖液 2. 將試驗樣品空白對照，樣品和稀釋的標準品加100ul至相應的孔內；（內部操作程序一樣） 3. 蓋板，37℃下孵育1小時（4℃下孵育過夜） 4. 洗板，重復7次以上，吸水紙上拍干；洗板機則洗板4次 5. 每孔加入100ul的標記抗體液，除Reagent Blank孔外 6. 蓋板，37℃下孵育30min 7. 洗板9次，同步驟四 8. 吸取試驗所需的TMB底物液于一次性試管內，每孔加入100ul的TMB底物液。剩余的TMB底物液不能再放回至原裝瓶內，避免污染 9. 黑暗處，室溫下孵育30min，溶液變藍 10. 每孔加入100ul的終止液，溶液變藍 11. 擦去微孔板底部的污點或水滴，終止液加入后30min內，在酶標儀450nm處讀數 特別注意 1. 試驗樣品采集后應立即檢測，凍存的樣品避免反復凍融，檢測前應先將其完全溶解混勻 2. 試驗樣品用EIA緩沖液稀釋 3. 試驗樣品和標準品應做雙份檢測 4. 試驗樣品應在中性PH范圍，有機溶劑的污染可能會影響檢測 5. 只能用試劑盒提供的洗滌液洗板，否則會導致試驗失敗 6. 吸水紙上拍干微孔板，不能擦拭 7. TMB底物液應貯存于黑暗處，因其對光敏感，且避免接觸金屬 8. 加入終止液后30min內必須酶標儀讀數 結果計算 繪制曲線前，所有的數據都應減去試驗樣品空白值，包括標準品和未知的樣品。以標準品的OD值和濃度在對數-對數坐標紙上繪制標準曲線，從標準曲線上可直接讀取未知樣品的濃度 附：采用全自動酶標儀檢測，只需檢測前設置好酶標儀的相關參數，如坐標參數（線性，半對數）和計算方式參數（三次回歸、四參數或雙對數曲線方程），即可直接得到結果 附錄一： 
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