實驗方法原理 利用逆轉錄病毒轉染法將增強型綠色熒光蛋白基因導入人肺癌大細胞系NCI-H460，采用外科原位移植法建立肺癌原位移植模型。定期通過小動物活體熒光成像系統觀察腫瘤生長，利用相關性檢驗分析熒光面積和腫瘤體積之間的相關關系，并觀察原位移植術后裸鼠的生存期和腫瘤轉移情況。
實驗材料 BALB cnu nu裸鼠人非小細胞肺癌NCI-H460
試劑、試劑盒 EGFP表達載體大小鼠專用顆粒飼料胎牛血清生理鹽水青霉素鏈霉素RPM1-1640培養基
儀器、耗材 醋酸纖維濾膜C孵育箱96孔板針頭注射器鑷子棉簽凈化工作臺剪刀
實驗步驟
一、 實驗材料準備
BALB/c（nu/nu）裸鼠，雌雄不限。4周齡-6周齡，22只，體重18 g-22 g。所有裸鼠在SPF級屏障系統中飼養并進行實驗（。飼養室相對濕度為（55±10）%，溫度為（22±2）℃，光照12 h明暗交替，裸鼠飼養用的飼料為鈷60輻射滅菌過的大小鼠專用顆粒飼料（江蘇省協同醫藥生物工程有限公司）。
二、 表達綠色熒光蛋白的H460肺癌細胞系的建立
1. 在含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素的RPM1-1640上清液中培養PT67包裝細胞。
2. 當細胞達到80%-90%融合濃度時收集培養液，經孔徑為0.45 μm的醋酸纖維濾膜過濾后備用。
3. 轉染前24 h更新NCI-H460新鮮培養基，加入含逆轉錄病毒液的培養基轉染4 h后，置于37℃孵育箱孵育36 h，在熒光顯微鏡下觀察熒光。
4. 收集轉染細胞，在含200 μg/mL的G418選擇性培養基培養細胞。
5. 逐步將G418濃度增加200 μg/mL-400 μg/mL，直至抗性克隆形成。
6. 用96孔板單個細胞分離方法分離高表達GFP的克隆株，混合分離克隆株，使用常規方法擴增。
7. 經體外連續傳代培養3個月，檢測熒光的表達強度。
三、原位移植模型的建立
1. 將H460-GFP細胞懸浮于PBS液中，調整細胞濃度為5×106/mL。
2. 消毒裸鼠左側腋下皮膚，將0.2 mL細胞懸液用1 mL帶有27G1/2針頭的注射器接種于2只裸鼠皮下，形成一皮丘，干棉簽壓迫。
3. 當皮下移植瘤長至直徑約10 mm時剝取移植瘤，選擇生長良好、瘤結無破潰的荷瘤裸鼠，在凈化工作臺內，無菌操作下完整剝離瘤結，生理鹽水洗去血漬。
4. 剪開瘤結，清除中心的壞死組織，剪成直徑約1 mm大小的米粒樣小瘤塊。
5. 20只裸小鼠接受外科原位移植術。
6. 異氟烷吸入麻醉，將裸鼠置于右側臥位，四肢適當固定。
7. 消毒左側胸壁皮膚，在近第4、5肋間位置的皮膚切一0.4 cm-0.5 cm的橫切口，銳性分離胸壁肌肉，暴露肋骨和肋間肌，打開胸腔。
8. 用鑷子固定左肺，將準備好的瘤塊縫合在左肺上，無菌縫合線縫合關閉胸腔。
9. 立即檢查縫合情況，如果漏氣，繼續縫合，直至胸壁完全縫合。
10. 用5 mL注射器做胸腔內穿刺抽氣，縫合胸壁肌肉和皮膚。
11. 裸鼠放回原飼養籠，繼續飼養。
四、 監測指標
1. 術后每天觀察裸鼠有無并發癥及異常情況（活動，神經功能，呼吸，動物外觀）。
2. 腫瘤種植后每周麻醉處死2只裸鼠，共4周。
3. 銳性分離左側皮膚肌肉。
4. 在熒光體視顯微鏡下打開胸腔和腹腔，分別在自然光源和熒光激發狀態下拍照。
5. 使用小動物活體成像系統檢測GFP的表達，發射波長為520 nm，激發波長為480 nm，曝光時間為1 s，IPP軟件定量分析熒光面積。
6. 觀察原位移植瘤生長情況，經典方法測量腫瘤體積：用游標卡尺測量腫瘤的最長徑（a）和與之垂直的最短徑（b），根據公式計算腫瘤體積：腫瘤體積（V）=ab2/2（a、b以mm為單位）。
7. 以腫瘤接種天數為橫坐標，腫瘤接種部位熒光面積為縱坐標，繪制原位腫瘤生長曲線。
8. 其余裸鼠每周打開胸部皮瓣，戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，或者用手固定裸鼠，在自然光源和熒光激發狀態下拍照。
9. 當裸鼠出現惡病質后，解剖荷瘤鼠，肉眼觀察腫瘤生長情況及周圍臟器受累情況，并拍照。
五、統計學處理
采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，熒光面積和腫瘤體積用Mean±SD表示，Pearson相關性檢驗分析活體腫瘤面積與腫瘤體積之間的相關性，以P<0.05為差異具有統計學意義。
其他
一、實驗討論
體內移植模型是腫瘤實驗研究的主要方法。1969年Rygaard等首次成功地在裸小鼠中移植人結腸癌以后，人們開始利用裸小鼠進行腫瘤移植的研究。皮下移植動物模型及轉基因動物模型均不能很好地體現臨床轉移和藥物敏感性。1991年Fu等創立了外科原位移植方法，它采用的移植物直接來自新鮮外科標本或者移植性人腫瘤細胞或瘤細胞系，通過手術將腫瘤原位移植至裸鼠體內建立腫瘤模型。眾多學者通過前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等原位移植瘤的動物實驗模型證實原位移植模型技術是一種巨大的進步，它的轉移率和轉移模式更接近于臨床。
1994年Chalfie等首次在大腸埃希菌和線蟲中表達GFP，開創了GFP應用研究的先河。近年來，綠色熒光蛋白已成為應用最為廣泛的標記性蛋白質之一。GFP基因表達的綠色熒光蛋白受到藍光或紫光照射時可自發地發出綠色熒光，熒光信號強度高，易于被捕獲，無需其它底物或輔助因子的協助便可直接通過熒光顯微鏡或流式細胞儀等進行檢測，觀察直觀方便；同時，還具有穩定性好、耐受性強、對組織或細胞無毒性和易于構建載體等優點。因此，GFP在腫瘤的生長、療效評價等方面均已獲得廣泛應用。
活體動物體內光學成像技術將GFP基因直接轉染至腫瘤細胞，根據熒光蛋白的觀測和定量分析直接反映研究細胞的生物學特性。熒光蛋白內在的生色團，在簡單的儀器如帶有窄帶過濾片和激發濾波片的藍色發光二極管照射下，能發射藍色激發光，激發熒光蛋白發光。觀察者通過合適的看片燈和約490 nm波長的導光纖維光轉移。隨著研究人員對熒光蛋白的深入探討，發現發射光譜在近紅外波段的熒光蛋白更適合深部動物組織成像。紅色熒光蛋白產生的熒光顯像將更敏感，周圍組織的吸收和散射減少。目前已發現的最亮的熒光蛋白是一種叫Katushka的紅色熒光蛋白，發射波長超過620 nm，具有快速成熟、高pH穩定性和光穩定性的特點，將來可能會使肺部腫瘤活體動物的非侵入全身成像成為現實。
綜上所述，本實驗利用SOI法構建的表達綠色熒光蛋白的肺癌裸鼠原位模型，通過觀察綠色熒光蛋白能夠客觀評價NCI-H460-EGFP細胞在裸小鼠體內的生長情況，從而發現肉眼無法發現的微小轉移灶，在探索肺癌的生長、轉移等機制的研究中有重要的價值。同時本研究還證實了在該模型中可以通過測量熒光面積推測腫瘤體積，從而定量分析腫瘤在體內的生長情況，為藥物治療的臨床前研究提供新的實驗工具。
