隨著超速離心機轉速的提高,用超速角式轉頭分離人血清中白蛋白與球蛋白的離心時間越來越短,用5—20%線性蔗糖梯度作蛋白質速率—區帶(Rate—zonal)分離,樣品以近等速沉降,低于分析實驗結果。下面的簡單分離實例有代表性。
設備:
離心機:智能型超速離心機(Hitachi CP—M系列,Beckman L—XP系列)
轉頭:定角:P90AT,P80AT,比較實驗轉頭:P40ST
P90AT: 90,000rpm, 700,000xg, 8×12ml K=25
P80AT: 80,000rpm, 615,000xg, 8×12ml K=27
P40ST: 40,000rpm, 284,000xg, 6×13ml K=139
離心管:12ml及13ml PA管
樣品:標準人血清1 ml (2.5mg/ml),用0.15M NaCl溶解。
梯度液:5—20% 線性蔗糖梯度, P90AT及P80AT梯度液量約9.5ml ,P40ST梯度液量約9.6ml。
方法:5—20%蔗糖梯度液上鋪約1ml 人血清,對 P90AT及P80AT必須裝滿(用血清調節),P40ST加樣至距管口3mm。
離心參數:
P90AT:90,000rpm,2小時,2.5小時,3小時,5℃,加速“5”減速“5”
P80AT:80,000rpm,2小時,2.5小時,3小時,5℃,加速“5”減速“5”
P40ST:40,000rpm,14小時,16小時,18小時,5℃,加速“8”減速“8”
曲線繪制:用日立DGF—U 梯度儀通過上口連續取樣至帶流動池分光光度計連續測O.D.(280nm)后收集。
結果及分析:
轉頭 | 白蛋白峰頂距離從管口算起的容量(ml) | 球蛋白峰頂距離從管口算起的容量(ml) | ||||
P90AT | 2小時 | 2.5小時 | 3小時 | 2小時 | 2.5小時 | 3小時 |
4.5 | 5.7 | 6.8 | 6.2 | 7.9 | 9 | |
P80AT | 4.3 | 5.5 | 6.6 | 6 | 7.6 | 8.7 |
P40ST | 14小時 | 16小時 | 18小時 | 14小時 | 16小時 | 18小時 |
3.6 | 4.1 | 4.7 | 5.0 | 5.8 | 6.6 |
轉頭 | 白蛋白峰頂在蔗糖梯度位置% | 球蛋白峰頂在蔗糖梯度位置% | ||||
P90AT | 2小時 | 2.5小時 | 3小時 | 2小時 | 2.5小時 | 3小時 |
10.0 | 11.7 | 13.2 | 12.7 | 14.7 | 16.7 | |
P80AT | 9.9 | 11.6 | 13.0 | 12.5 | 14.5 | 16.5 |
P40ST | 14小時 | 16小時 | 18小時 | 14小時 | 16小時 | 18小時 |
7.5 | 8.3 | 9.0 | 9.9 | 11.0 | 12.0 |
分析:根據以上結果,可以看出:
1.在5—20%蔗糖線性梯度中白蛋白與球蛋白基本上以等速沉降
2.用P40ST或P80AT轉頭分離人血清白、球蛋白在最高轉速離心2.5小時效果最佳,用P40ST轉頭離心18小時效果最好。
3.用P40ST轉頭分離的結果O.D. 對離心管從管口算起容量曲線的峰形比P90AT的峰形尖銳一些,但考慮到離心機和轉頭的壽命,用P80AT 轉頭離心性價比最佳。