實驗材料 寡核苷酸引物
試劑、試劑盒 氨芐青霉素磷酸緩沖生理鹽水Tris-氯化氫SDS-PAGE
儀器、耗材 DNA 測序儀色譜設備
實驗步驟
本節描述的方法大概包括：
( 1 ) 設計的鋅指蛋白的表達和純化。
( 2 ) 人工鋅指設計技巧。
( 3 ) 人工鋅指構建步驟。
( 4 ) 鋅指結構和金屬配位的確認。
3.1 人工鋅指蛋白的表達和純化
設計的人工鋅指蛋白的表達和純化方法在 3.1.1 和 3.1.6 節描述，包括：
( 1 ) 表達載體 pEV-3b 的構建；
( 2 ) 蛋白質以可溶和不可溶形式表達；
( 3 ) 用陽離子交換和凝膠過濾色譜純化蛋白；
( 4 ) 失活結構的再折疊；
( 5 ) 鋅指結構和金屬配位的確認。
3.1.1 pEV-3b 表達載體
pEV-3b 表達載體是基于 pET3b 表達載體（Novagen；圖 5.1 )。這個載體被改造過，以生成有用的多克隆位點，用于研究鋅指基因。
( 1 ) 從 pET3b 中切除 EcoRI/Hind lll 降解片段。
( 2 ) 為了切除 EcoRI 和位點，將退火的寡核苷酸 5'-AATTGTCATGTTTGAC-3，和 5，- AGCTGTCAAACATGAC-3，插入 EcoRI/Hind lll 降解的 pET3b。產生的質粒記為 pET3b'。
( 3 ) 制備包括限制性酶 AflII 、Bam HI、EcoRI、Hind lll 和 S mal 酶切位點的雙鏈寡核苷酸。這兩條鏈的序列為 5'-TATGGATCCCGGGAATTCAAGCTTAAGC-3' 和 5'-TCAGCTTAAGCTTGAATTCCCGGGATCCA-3'。
( 4 ) 用 Nde l 和降解，并將這一片段插入 pET3b'，得到質粒 pEV-3b。
得到的質粒 pEV-3b 用來表達設計的鋅指蛋白。把鋅指基因作為 Bam HI/EcoRI 片段插入類似地降解的 pEV-3b，只用一步就構建了人工鋅指的表達載體。
3.1.2 設計的人工鋅指蛋白的表達
( 1 ) 把帶有設計的鋅指蛋白基因的 pEV-3b 質粒轉化到大腸桿菌菌株 BL21 ( DE3 ) pLysS 中。
( 2 ) 在 37°C 于 Luria- Bertani 培養基中培養細胞。
( 3 ) 當在 600 nm 的光密度為 0.6 時加入 1 mmol/L IPTG。
( 4 ) 培養液在 20°C 保育 8~12 h。為了表達溶解狀態的蛋白質，這個溫度很重要。
3.1.3 設計的人工鋅指蛋白的純化
純化步驟在 4°C 下完成。
( 1 ) 收獲大腸桿菌細胞，重懸，并在 PBS 中裂解。
( 2 ) 離心后，用陽離子交換色譜（高 S 和 UNO S-1；Bio- Rad) 和用 Tris-氯化氫緩沖液凝膠過濾（Superdex 75；Amersham Biosciences)，純化溶有鋅指蛋白的上清液。
( 3 ) 用 SDS-PAGE 確認蛋白純度。
為進行金屬取代實驗，不溶形式的鋅指蛋白也在離心后從大腸桿菌細胞小團中純化出來：
( 1 ) 在含 8 mmol/L 尿素和 10 mmol/L 螯合劑（EDTA 或 1，10-鄰二氮雜菲）的 PBS 中裂解細胞小團。
( 2 ) 根據 3.1.3 小節 第（2 ) 步的描述，以同樣步驟純化。
( 3 ) 在 65°C 加熱純化蛋白 30 min，并在含 125 μmol/L 氯化鋅、硝酸鎳、氯化鎘、 硝酸鈷或硫酸銅的 10 mmol/L Tris 緩沖液中逐步降溫，使之重新折疊。
3.1.4 CD 測量
鋅指蛋白的 CD 譜用 Jasco J-720 分光偏振計記錄。20°C，使用 pH 8.0 的含有 50 mmol/L 氯化鈉的 Tris-氯化氫緩沖液。容器須有蓋，1 mm 光程，氮氣環境。所有的譜平均掃描 8~16 次。使用 Jasco 軟件校準譜的基線并降低噪聲。
3.1.5 UV-VIS 吸收譜
UV-VIS 吸收譜用 Beckman Coulter DU7400 二極管陣列光譜儀，20°C，使用 pH 7.5 的含 50 mmol/L 氯化鈉的 10 mmol/L Tris-氯化氫緩沖液。容器須有蓋，1 cm 光程。Co (II) - 取代的鋅指復合物用氯化鈷滴定得到。多肽在任意條件下用 Co (I I ) 飽和。所有的譜都用 e = A / ( l/c) ，式中 e 是消光系數 {/ [ (mol/L ) /cm]} ， l 是容器的光程 (cm)，c 是肽濃度（mol/L )。
3.1.6 NMR 實驗
在 1.5 mol Zn ( II ) 離子存在的條件下，單指結構域和 Zn (II) 的復合物在 90% H2O/10% D2O 和 D2O ( 25 mmol/L Tris-d11，pH 5.7 ) 中，以 5 mmol/L 濃度制備。所有的 NMR 譜都在 JOEL Lambda-600 譜儀上記錄。
( 1 ) 核 Overhauser 增強譜（NOESY) 數據采集，先用選擇性水預飽和（交替的延遲與進動以裁剪激發脈沖；一種水峰信號抑制技術，縮寫為 DANTE；原文 mutation 當為 nutation 之誤---- 譯者注），隨后溫度定在 303 K , 各使用混合時間分別為 100ms、200ms 和 300ms 的標準 NOESY 脈沖序列。
( 2 ) 采集總相關譜，用 80 ms MLEV-17 自旋鎖閉時長，在 303 K 用梯度修整脈沖以壓制水信號。
譜的典型采集條件是每個 t1 值（原文 valve 當為 value 之誤——譯者注）掃描 24 次，共 1024 個 t1 值，并且在直接維度收集 2048 個復數點。在兩個維度的自由感應衰減被乘以相移正弦鐘形限形函數、零填充，并經傅里葉變換為 2048X2048 矩陣。序列共振指認用標準的總相關譜和 NOESY 過程確定 [8] 。
3.2 6 和 9 鋅指蛋白
本節描述為識別長 DNA 序列所需的多鋅指蛋白的設計策略和構建。
3.2.1 蛋白質設計策略
全新的 6 和 9 鋅指蛋白（SplZF6 和 SplZF9 ) 是從轉錄因子 Sp1 的 3 鋅指模體創造出來的（圖 5.2 )。通過用 Kriippel 型連接子連接 2 或 3 個 Spl 鋅指結構域，構建出了這些蛋白質（見注 1 和注 2)。
3.2.2 Sp1ZF6 和 Sp1ZF9 基因的構建
編碼 Sp1 的 3 鋅指區域的基因 [pUC-Spl ( 530~623) ] 按如先前描述過的步驟構建 [9] 。
( 1 ) 合成編碼 Kriippel 型連接子（TGEKP ) 的一段寡核苷酸（84 bp) 為 BamHI/Sty I 片段，并將其插入 pUC-Spl (530~623) 。
( 2 ) 切出 Eco47 III 片段（264 bp) ，并將其插入簡單降解過的 pUC-Sp1 (530~623) 中。改變后的質粒重新命名為 pUC-Sp1ZF6。
( 3 ) 用 Agel 位引物對，即用 5'-ACCGGTGAAAAACCGCATATTTGCCACATAC-3' 為編碼鏈，并用 5'-CGGTTTTTCACCGGTGTGGGTCTTGATATG-3' 為非編碼鏈，將兩個 AgeI 位分別連接到編碼 SplZF9 的中間基因的 5' 端和 3' 端。
( 4 ) 把得到的用 Agel 修飾過的片段連接到 pUC-SplZF6 的 AgeI 位置。連接 2 或 3 個 Spl 片段間的 AgeI 酶切位點編碼氨基酸 TG，它是連接肽 TGEKP 的一部分。
( 5 ) 用 DNA 測序確認所有序列。
( 6 ) 作為 BamHI/Styl 片段切出 SplZF6 和 SplZF9 的 DNA 片段，并將其插入簡單降解過的質粒 pEV-3b 中（見 3.1 .1；參考文獻 [10] ) 。
3.3 DNA 彎折鋅指蛋白
3.3.1 和 5.3.3. 2 節描述 DNA 彎折鋅指的設計和構建。
3.3.1 蛋白設計步驟
通過連接 SP1 的 2 個 3 鋅指，構建出了新的 6 鋅指蛋白，包括多聚甘氨酸連接子、 SplZF6 (Gly)4、SplZF6 (Gly)7 (圖 5.3 ) 和 SplZF6 (Gly)1。交換 SplZF6 的 TGEKP 和 (Gly)n（n =4、7 或 10 ) 連接子，可以構建 SplZF6 (Gly)n ( 見注 3 和注 4)。
3.2 SplZF6 (Gly)n 的構建
包含有連接序列的合成寡聚核苷酸 A flll/Mfel 是從 Amer sham Biosciences 購置的。經過退火，這些寡聚核苷酸片段被插入到 pUC-Sp1ZF6 載體中。這樣得到的質粒被重新命名為 Sp1ZF6 (Gly)n ( n = 4 , 7 或 10)。這些編碼蛋白質的 DNA 片段在 Bam HI 和 Eco RI 位點被剪切下來，然后插入一個被同樣酶切的質粒，pEV-3b (見 5. 3.1 .1；參考文獻 [ 11 ])。
3.4 (His)4 型鋅指蛋白
3.4.1 和 3.4.2 節描述 (His)4 型鋅指蛋白的設計技巧、多肽合成和基因構建。
3.4.1 蛋白質設計策略通過對 3 (Cys)2 (His)2 型鋅指蛋白 Sp1 做突變 CysHis，創造出了一個新的 (His)4 型鋅指蛋白（圖 5.4)。實質上，存在（Cys)2 (His)2 — 、（Cys)3 (His) — 、 (Cys)4—和（Cys)6 —鋅指蛋白（見注 5)。
3.4.2 (His)4 型鋅指結構域的多肽合成
合成 3 鋅指 Sp1 之中指的（His)4 突變多肽（H4Sp1f2 )，在 Rink 氨基樹脂上用 9-芴甲氧羰基固相合成。肽鏈在 Shimadzu PSSM-8 合成儀上采用苯并三唑-1- 基氧 3 四氫吡咯磷、六氟合磷酸、（PyBOP) -1- 羥基苯并三氮唑 、（HOBO - N-甲基嗎磷啉、 (NMM ) 耦合系統標準工藝合成。被保護起來的 H4Sp1f2 肽樹脂，用三氟乙酸和乙醇 ( 95 : 5 ) 在室溫下處理 2 h，接著用高效液相色譜在 μBondesphere4C4-300 (19 X 50 mm) 柱上純化。產物的可靠性用飛行時間質譜（Kratos Kompact MALDI4 ) 驗證。
3.4.3 H4Sp1 的構建
(His)4 突變體 H4Sp1 通過將 Sp1 的 3 鋅指結構域的 6 個半胱氨酸突變為組氨酸構建。 編碼（His)4 的 DNA 片段，從 pUC-Sp1 (530-623) 用基于點突變的聚合酶鏈反應（PCR ) 得到，并且用 GeneRapidDNA (Amersham Biosciences ) 測序儀驗證。擴增的片段用 BamHI 和 Eco RI 切割后，插入簡單降解過的 pEY-3b 中（見 3.1.1; 參考文獻 [12])。
3.5 AT 識別鋅指蛋白
識別 AT 的鋅指的設計和構建分別在 3.5.1 和 3.5.2 節中描述。
3.5.1 蛋白質設計策略
(Cys)2 (His)2 型鋅指蛋白 Sp1 中的 3 鋅指結合于富含 GC 的序列，而 6 (Cys)2(His)2 型鋅指蛋白 CF2- II 中的 3 鋅指（4~6 指）結合于富含 AT 的序列。新的與 AT 富集序列結合的鋅指蛋白，用交換這兩個類型的鋅指蛋白的螺旋來合成（圖 5.5)。
3.5.2 Sp1HM 的構建
制備編碼 CF2- II 的 α 螺旋的寡核苷酸。基于 PCR 的點突變，用 pUC-Sp1 ( 530~623 ) 作為模板來逆行。PCR 擴增的突變片段用 Bam HI 和 Eco RI 降解后，插入簡單地降解過的 pEV-3b 質粒中（見 3.1.1；參考文獻 [13])。