實驗方法原理 將表達GFP的質粒pRNAT-U6/Neo轉染人肺腺癌細胞A549，G418篩選獲得穩定表達GFP細胞，對比轉染前后細胞的生長活性和成瘤性。將轉染后細胞原位種植裸鼠預定標準處死。HE染色和免疫組化檢測轉移灶的位置和數目。利用KODAK IS2000MM系統檢測腫瘤播散情況。
實驗材料 BALB c nu nu裸鼠腺癌細胞株A549
試劑、試劑盒 小牛血清RPMI-1640培養液pRNAT-U6 Neo磷酸鈣即用型SP超敏 感免疫組化染色試劑盒DAB Kit 顯色試劑盒甲醛EDTA戊巴比妥鈉
儀器、耗材 熒光顯微鏡光學顯微鏡
實驗步驟
一、實驗材料準備
1. BALB/c nu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周齡，體重18-20 g，無特定病原體(SPF)級飼養。
2. 肺腺癌細胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養基(美國Gibcobrl公司)，5% CO237℃培養，常規傳代。
3. 質粒和篩選藥物質粒pRNAT-U6/Neo(美國Genscript公司)，攜帶Neomycin耐藥基因供篩選，在CMV啟動子控制下編碼cGFP作為轉染標記物。G418(美國Promega公司)800 μg/ml初篩后200 μg/ml維持篩選。
二、細胞的轉染
1. 哺乳動物磷酸鈣轉染系統(美國Promega公司)，按照操作指南將質粒pRNAT-U6/Neoo轉入A549細胞，轉染后24~48 h熒光顯微鏡下觀察轉染效率。
2. 后培養液內加G418篩選獲得穩定轉染。
3. 利用平板克隆形成試驗測定細胞克隆形成率>10%后，有限稀釋法獲得表達GFP陽性細胞。
4. 1月后收獲轉染細胞，常規傳代培養，培養液中加G418(200 μg/ml)維持篩選。
5. 測定轉染后A549細胞增殖動力學指標，對比轉染前后A549細胞生長曲線，檢測轉染后細胞的生長活性是否受轉染的影響。
6. 待細胞增殖達一定數量后，裸鼠皮下注射轉染前后細胞，記錄成瘤時間，用公式V=1/2×長×寬 計算腫瘤體積，對比轉染前后兩組裸鼠的瘤體大小以檢測成瘤性是否有差別。
三、人肺腺癌A549裸鼠原位種植模型的建立
1. 取轉染后細胞，用不含血清的RMPI 1640培養液沖洗2次并調整細胞最終濃度為5×106/0.2 ml備用。
2. 用0.5%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)(中國醫藥上海化學試劑公司)腹腔注射麻醉裸鼠，用26號針頭吸取細胞懸液0.2 ml注射入裸鼠左側胸腔，注射過程中注意控制刺入針頭的深度。
3. 整個操作過程在細胞收獲后半小時內完成，嚴格遵循無菌原則。
4. 注射后在KODAK IS2000MM下確認原位種植成功，注射部位為胸腔。
5. 注射后繼續飼養，隔天觀察一次并記錄體重。
6. 當裸鼠出現精神萎靡、呼吸短促、弓背并明顯消瘦，體重較注射Et減輕20%時，頸椎脫位術處死裸鼠。
7. 開胸觀察，取出器官，用10%甲醛固定保存。
四、檢查項目
1. 轉染后細胞熒光顯微鏡成像轉染后24～48 h熒光顯微鏡下觀察，確認轉染成功。單克隆化過程中鏡下觀察細胞克隆生長情況。
2. 活體GFP標記成像檢測應用KODAK IS2000MM進行活體熒光成像，確認注射部位為胸腔，后間斷應用以活體確認瘤細胞的遠處轉移。
3. 解剖學與組織學檢查處死的裸鼠均經
詳細解剖學檢查，取出器官、固定包埋后，以4 tun厚度連續切片，切片嚴格編號，奇數號行HE染色，光鏡觀察，以初步確定轉移灶。
4. 免疫組織化學染色
選擇肺臟、肝臟和腦作為主要研究器官，在HE染色確定轉移灶位置的基礎上，取相鄰偶數號碼的切片進行免疫組化檢測，CEA鼠抗人單克隆抗體(ZM-0062)，LRP鼠抗人單克隆抗體(ZM．0335)工作液，即用型SP超敏感免疫組化染色試劑盒(sP-9000)、抗原修復液、DAB Kit顯色試劑盒(zU一9032)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
五、統計學處理
細胞的生長活性和腫瘤體積x±s表示，數值的比較采用方差分析。HE檢測結果和活體成像檢測結果的比較用x2檢驗。采用SPSSl3．0軟件進行統計分析。
其他
一、實驗討論
基于腫瘤生長、侵襲和轉移的“種子和土壤”學說，腫瘤細胞在體內的生長和播散具有器官特異性。原位種植法模擬肺癌發生的自然環境，是建立肺癌轉移模型的最佳方法。腫瘤學研究中應用最多的皮下種植法建立的模型只是局部包塊而無遠處器官的轉移和播散，不出現腫瘤相關癥狀。McLemom等最早用支氣管內注射的方法在裸鼠右肺內建立了人肺癌原位模型：腫瘤的生長較皮下種植法廣泛，但播散僅限于右肺內，未發展有遠處轉移時裸鼠就因肺內病變而死亡，同時技術條件要求較高，手術相關死亡率高達5%，用來建立NSCLC轉移模型可行性差。本研究采用胸腔內原位注射法，操作較支氣管內注射法簡單可行，手術死亡率低，種植部位為肺內，模擬臨床NSCLC轉移的自然發生情形，兼顧實驗的可行性和可信性，表現出和臨床相像的晚期NSCLC系列癥狀，和臨床相似的肝、腦轉移率，病理解剖過程中觀察到的體內播散也和臨床吻合，證實胸腔內原位注射法適合用于建立NSCLC轉移模型。
原位種植法建立的模型為體內深部組織生長，腫瘤生長和播散的檢測和評價較困難。常規采用每隔幾天處死一定數量裸鼠后行病理分析，來檢測腫瘤的生長和播散，這種方法需要較多裸鼠，而且耗費大量時間和精力。KODAK IinageStation 2000MM是KODAK公司運用近紅外成像技術制造的一套多功能成像系統，它利用內置的紫外epi．illumination(300～400 nm)光源及多達6種不同的濾光片高效率激發各種熒光標記物。本研究中將攜帶GFP的質粒轉染人人肺腺癌細胞株A549作生物示蹤，細胞生長活性和成瘤性均未受轉染的影響，顯像時無需注射底物即檢測腫瘤的侵襲和播散。這種檢測方法顯著簡化了上述常規方法，在多個方面有益于對所建模型的評價：①在最初注射時即可用來確認注射部位的準確性和注射細胞數量的精確性；②因為種植后產生的轉瘤在數目和體積上有差異，通過這種體內成像系統能選擇最有代表性的靶病灶；③無須處死裸鼠即可非侵人性、無創性、體外實時顯像評價腫瘤在體內的播散和遠處轉移；④選擇公認的全身嚴重衰竭、呼吸短促、體重減輕20%為裸鼠處死標準，而不是常規的繪制Kaplan—Meier生長曲線，應用小數量的裸鼠即可獲得有意義的統計學結果，大幅減少了研究人員的工作量。統計學分析證實其肝轉移和腦轉移檢測結果與病理檢測結果無差異，說明利用這種方法檢測肺癌遠處轉移結果可信。
胸腔內原位種植法操作簡便，重現臨床NSCLC轉移過程；GFP轉入人肺腺癌A549細胞對生長活性和致瘤性無影響，A549/GFP用于NSCLC轉移模型結果可靠；借助于熒光顯像設備，利用GFP的示蹤功能可以非侵人性檢測NSCLC轉移。
