從全血中純化基因組DNA實驗方法

發布時間：2019-09-12 18:41 原文鏈接：從全血中純化基因組DNA實驗方法

試劑、試劑盒	乙醇異丙醇 RNA 酶 A 全血
儀器、耗材	瓊脂糖凝膠電泳離心管 Wizard 基因組 DNA 純化試劑盒
實驗步驟	一、材料 1. 緩沖液、溶液和試劑乙醇，70%，室溫異丙醇, 室溫 RNA 酶 A 將 RNA 酶 A 溶解于 DNA 再水合液中至終濃度為 4 mg/ml, 煮沸 10min 以去除 DNA 酶的污染。分裝后保存于-20°C。 2. 專用設備瓊脂糖凝膠電泳設備 50 ml 的消毒離心管 3. 其他 Wizard 基因組 DNA 純化試劑盒（Promega; 包括細胞裂解液、核裂解液、蛋白質沉淀液和 DNA 再水合液) 分子量標記，用于瓊脂糖凝肢電泳 4. 細胞和組織全血 (10 ml) 二、方法 1. 血紅細胞的裂解 (1) 在 50 ml 已消毒的離心管中加入 30 ml 細胞裂解液 (2) 輕輕搖動血液樣品管至樣品完全混合；然后將血樣 (10 ml) 轉移到已加有細胞裂解液的管中，將管顛倒 5 或 6次使之混合， (3) 將混合物在室溫下溫育 l0min(期間顛倒混合 3 次）以裂解血紅細胞，室溫下以 2000 g 離心 l0min。 (4) 在不破壞白色可見沉降物的前提下盡量移除上液，大約會有 1.4 ml 的殘液。如果血樣已經凝固再加入 30 ml 細胞裂解液，顛倒 5 或 6 次混合。重復 (3) 和 (4) 直到沉降物幾乎完全變白。從凝固樣品中提取 DNA 可能會有一些損失。在步驟 (4) 中，可能會看到白細胞中也漫有一些血紅細胞或細胞碎片。如果沉降物中似乎只含有血紅細胞，那么棄上清液后在細胞沉降物中再加入 30 ml 細胞裂解液，然后重復 (3) 和 (4)。 (5) 劇烈振蕩試管直到白細胞重懸于其中（10~15s)。 2. 核的裂解和蛋白質的沉淀 (1) 向含有重懸細胞的試管中加入 l0 ml 核裂解液，抽吸溶液 5 或 6 次使白細胞裂解，這樣溶液將會變得非常黏滯。混合后如果有成塊細胞出現，那么將溶液放置于37°C 進行溫育直至細胞塊完全破壞。若 lh 后仍然能夠看到細胞塊，則再加 3 ml 核裂解液，反復溫育處理。 (2) 可選擇的步驟：向核裂解產物中加入 RNA 酶 A20ug/ml, 顛倒試管 2?5 次進行混合，混合物在 37°C 溫育 15 min, 然后冷卻至室溫。 (3) 向核裂解產物中加入 3.3 ml 蛋白質沉淀液，劇烈蕩 10?20s 后可能會看到小的蛋白質塊。 (4) 室溫下 2000 g 離心 lOmin 后將看到一個深褐色的白質塊。 3.DNA 的沉淀和再水合 (1) 室溫下，將上清液轉移到一個裝有 10 ml 異丙醇的50 ml 干凈試管中。 (2) 輕輕顛倒混合溶液直至白色線狀 DNA 變形可見的塊狀 DNA。 (3) 室溫下以 2000 g 離心 1 min 后將會有小塊的白色 DNA 沉降出現 (4) 室溫下慢慢倒出上清液，加入 l0 ml70% 乙酵，輕柔地顛倒試管數次以洗滌 DNA 沉淀和試管壁，然后按照 (3) 進行離心。 (5) 小心吸出乙醇。此時的 DNA 沉降非常松散，必須小心避免將沉降物吸到移液管中將試管顛倒后放置在干凈的吸水紙上，風干沉降物 10~15 min。 (6) 加入 800ulDNA 再水合液，65°C 溫育 lh 使 DNA 再水合，期間定時輕敲試管以使溶液混合。再水合 DNA 的另一個方法是在室溫或 4°C 將溶液溫育過夜。 (7) 在 2~8°C 儲存 DNA。 4. 分離 DNA 的定性和定量可以通過測定 DNA 在 260mn 下的吸光度或者通過瓊脂糖凝膠電泳來測定純化樣品相對于標準樣的量等方法來對 DNA 進行定量。如果需要精確的濃度，推薦使用后一種方法而不是由分光光度計來確定，因為吸光度的讀數可因樣品中低分子量紫外線吸收物質的存在而偏高（Glasel1995)。通常 10 ml 全血的 DNA 產量為 250~500ul（表 9-1)。用該方法分離的 DNA 質量可以通過測定擴增的長度和 PCR 擴增的能力來估測（Saikiet al.1985) 脈沖場凝膠電泳結果顯示由該方法分離的 DNA 片段絕大部分在 50?200kb(圖9-2)。所分離 DNA 與 PCR 擴增的兼容性可以通過對 3 個人多態性位點的成功擴增來證明。對來自 5 個不同個體的樣品（25ug）都進行了高效擴增，每個位點都產生相同類型的平行帶（圖 9-3)。展開

試劑、試劑盒

乙醇異丙醇 RNA 酶 A 全血

儀器、耗材

瓊脂糖凝膠電泳離心管 Wizard 基因組 DNA 純化試劑盒

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

乙醇，70%，室溫

異丙醇, 室溫

RNA 酶 A

將 RNA 酶 A 溶解于 DNA 再水合液中至終濃度為 4 mg/ml, 煮沸 10min 以去除 DNA 酶的污染。分裝后保存于-20°C。

2. 專用設備

瓊脂糖凝膠電泳設備

50 ml 的消毒離心管

3. 其他

Wizard 基因組 DNA 純化試劑盒（Promega; 包括細胞裂解液、核裂解液、蛋白質沉淀液和 DNA 再水合液)

分子量標記，用于瓊脂糖凝肢電泳

4. 細胞和組織

全血 (10 ml)

二、方法

1. 血紅細胞的裂解

(1) 在 50 ml 已消毒的離心管中加入 30 ml 細胞裂解液

(2) 輕輕搖動血液樣品管至樣品完全混合；然后將血樣 (10 ml) 轉移到已加有細胞裂解液的管中，將管顛倒 5 或 6次使之混合，

(3) 將混合物在室溫下溫育 l0min(期間顛倒混合 3 次）以裂解血紅細胞，室溫下以 2000 g 離心 l0min。

(4) 在不破壞白色可見沉降物的前提下盡量移除上液，大約會有 1.4 ml 的殘液。如果血樣已經凝固再加入

30 ml 細胞裂解液，顛倒 5 或 6 次混合。重復 (3) 和 (4) 直到沉降物幾乎完全變白。從凝固樣品中提取 DNA 可能會有一些損失。

在步驟 (4) 中，可能會看到白細胞中也漫有一些血紅細胞或細胞碎片。如果沉降物中似乎只含有血紅細胞，那么棄上清液后在細胞沉降物中再加入 30 ml 細胞裂解液，然后重復 (3) 和 (4)。

(5) 劇烈振蕩試管直到白細胞重懸于其中（10~15s)。

2. 核的裂解和蛋白質的沉淀

(1) 向含有重懸細胞的試管中加入 l0 ml 核裂解液，抽吸溶液 5 或 6 次使白細胞裂解，這樣溶液將會變得非常黏滯。混合后如果有成塊細胞出現，那么將溶液放置于37°C 進行溫育直至細胞塊完全破壞。若 lh 后仍然能夠看到細胞塊，則再加 3 ml 核裂解液，反復溫育處理。

(2) 可選擇的步驟：向核裂解產物中加入 RNA 酶 A20ug/ml, 顛倒試管 2?5 次進行混合，混合物在 37°C 溫育 15 min, 然后冷卻至室溫。

(3) 向核裂解產物中加入 3.3 ml 蛋白質沉淀液，劇烈蕩 10?20s 后可能會看到小的蛋白質塊。

(4) 室溫下 2000 g 離心 lOmin 后將看到一個深褐色的白質塊。

3.DNA 的沉淀和再水合

(1) 室溫下，將上清液轉移到一個裝有 10 ml 異丙醇的50 ml 干凈試管中。

(2) 輕輕顛倒混合溶液直至白色線狀 DNA 變形可見的塊狀 DNA。

(3) 室溫下以 2000 g 離心 1 min 后將會有小塊的白色 DNA 沉降出現

(4) 室溫下慢慢倒出上清液，加入 l0 ml70% 乙酵，輕柔地顛倒試管數次以洗滌 DNA 沉淀和試管壁，然后按照 (3) 進行離心。

(5) 小心吸出乙醇。此時的 DNA 沉降非常松散，必須小心避免將沉降物吸到移液管中

將試管顛倒后放置在干凈的吸水紙上，風干沉降物 10~15 min。

(6) 加入 800ulDNA 再水合液，65°C 溫育 lh 使 DNA 再水合，期間定時輕敲試管以使溶液混合。再水合 DNA 的另一個方法是在室溫或 4°C 將溶液溫育過夜。

(7) 在 2~8°C 儲存 DNA。

4. 分離 DNA 的定性和定量

可以通過測定 DNA 在 260mn 下的吸光度或者通過瓊脂糖凝膠電泳來測定純化樣品相對于標準樣的量等方法來對 DNA 進行定量。如果需要精確的濃度，推薦使用后一種方法而不是由分光光度計來確定，因為吸光度的讀數可因樣品中低分子量紫外線吸收物質的存在而偏高（Glasel1995)。通常 10 ml 全血的 DNA 產量為 250~500ul（表 9-1)。

用該方法分離的 DNA 質量可以通過測定擴增的長度和 PCR 擴增的能力來估測（Saikiet al.1985) 脈沖場凝膠電泳結果顯示由該方法分離的 DNA 片段絕大部分在 50?200kb(圖9-2)。所分離 DNA 與 PCR 擴增的兼容性可以通過對 3 個人多態性位點的成功擴增來證明。對來自 5 個不同個體的樣品（25ug）都進行了高效擴增，每個位點都產生相同類型的平行帶（圖 9-3)。