從動物組織提取基因組DNA

實驗概要

本實驗以哺乳動物新鮮組織為材料，學習基因組DNA提取的一般方法。

實驗原理

基因組DNA的提取通常用于構建基因組文庫、Southern雜交(包括RFLP)及PCR分離基因等。利用基因組DNA較長的特性，可以將其與細胞器或質粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團飄浮其中，可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部，從而達到提取的目的。在提取過程中，染色體會發生機械斷裂，產生大小不同的片段，因此分離基因組DNA時應盡量在溫和的條件下操作，如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩，以保證得到較長的DNA。一般來說，構建基因組文庫，初始DNA長度必須在100kb以上，否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進行RFLP和PCR分析，DNA長度可短至50kb，在該長度以上，可保證酶切后產生RFLP片段(20kb以下)，并可保證包含PCR所擴增的片段(一般2kb以下)。

不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同;  不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結構及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時必須參照文獻和經驗建立相應的提取方法，以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質對隨后的酶切、PCR反應等有較強的抑制作用，因此用富含這類物質的材料提取基因組DNA時，應考慮除去多糖和酚類物質。

主要試劑

1. 分離緩沖液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4，10mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA。

2. 10% SDS

3. 蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)

4. 乙醚

5. 酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)

6. 無水乙醇及70%乙醇

7. 5mol/L NaCl

8. 3mol/L NaAc

9. TE等

主要設備

1. 移液管

2. 高速冷凍離心機

3. 臺式離心機

4. 水浴鍋

實驗材料

哺乳動物新鮮組織。

實驗步驟

1. 切取組織5g左右，剔除結締組織，吸水紙吸干血液，剪碎放入研缽(越細越好)。

2. 倒入液氮，磨成粉末，加10ml分離緩沖液。

3. 加1ml 10% SDS，混勻，此時樣品變得很粘稠。

4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K，37℃保溫1-2小時，直到組織完全解體。

5. 加1ml 5mol/L NaCl，混勻，5000rpm離心數秒鐘。

6. 取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后，3000rpm離心 5分鐘。

7. 取上層水相至干凈離心管，加2倍體積乙醚抽提(在通風情況下操作)。

8. 移去上層乙醚，保留下層水相。

9. 加1/10 體積3mol/L NaAc，及2倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。

10. 用玻棒鉤出DNA沉淀，70%乙醇中漂洗后，在吸水紙上吸干，溶解于1ml TE中，-20℃保存。

11. 如果DNA溶液中有不溶解顆粒，可在5000rpm短暫離心，取上清; 如要除去其中的RNA，可加5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃保溫30分鐘，用酚抽提后，按步驟9-10重沉淀DNA。

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