從培養細胞中制備細胞核基質/中間纖維骨架結構
從組織中分離制備細胞核基質/中間纖維支架結構
細胞核的預先分離
| 實驗材料 | 細胞 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | Tritron X-100 抽提緩沖液 |
| 儀器、耗材 | 電子顯微鏡 |
| 實驗步驟 | 1. 在 4℃ 用 PBS 洗細胞一次。 2. 在 4℃ 用含 0.5% Tritron X-100 的細胞骨架緩沖液抽提細胞 3 到 5 分鐘。直到消化步驟，每 107 個細胞最少要用 1 ml 緩沖液，以后減半。 3. 在 4℃ 用抽提緩沖液抽提細胞 3~5 分鐘。這一步去除組蛋白 H1 和除中間纖維蛋白之外的細胞骨架蛋白。另外，這一步也可在 DNA 酶消化步驟（第 4 步）之后作，這樣也不會引起超微結構的變化。 抽提緩沖液： 10 mmol/L PIPES，pH 6.8 250 mmol/L 硫酸銨 300 mmol/L 蔗糖 3 mmol/L MgCl2 1 mmol/L EDTA 4. 在含 0.5% Triton X-100 的消化緩沖液中用無 RNA 酶的 DNA 酶消化以去除染色質 DNA 酶濃度為 200~400 單位/ml，32℃ 反應 30~50 分鐘。 含 0.5% Triton X-100 的消化緩沖液： 10 mmol/L PIPES，pH 6.8 300 mmol/L 蔗糖 50 mmol/L NaCl 3 mmol/L MgCl2 1 mmol/L EGTA 5. 用抽提緩沖液清洗樣品兩次，每次 5 分鐘。 6. （可選）樣品在 4℃ 用 2 mol/L NaCl 抽提 3~5 分鐘。這一步能使可能形成核基質核心的 10 nm 纖絲分支顯形（Jackson and Cook 1988; He et al, 1990)。在第 4 步中用 Hae Ⅲ 和 Pst Ⅰ（每種酶 400 單位/ml）代替 DNA 酶 Ⅰ 可以使核心纖絲保存的更好。 2 mol/L NaCl 緩沖液： 10 mmol/L PIPES，pH 6.8 300 mmol/L 蔗糖 2 mol/L NaCl 3 mmol/L MgCl2 1 mmol/L EGTA 7. 固定核基質以進行免疫熒光檢測或電子顯微鏡檢測。 |