| 實驗材料 | 細胞 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 環己酰亞胺 勻漿緩沖液 |
| 儀器、耗材 | 培養皿 |
| 實驗步驟 | 1. 培養基中加入環己酰亞胺（溶于蒸餾水，貯存液濃度 0.1 mol/L，-20℃ 保存。如果不溶，試著加熱到 40℃ 以幫助溶解）（終濃度 10 μmol/L)，37℃ 保溫 5~10 分鐘。 2. 培養皿從 37℃ 轉移到冷室，立即去掉培養基，用含有與培養基同樣環己酰亞胺濃度的冰冷 PBS 洗滌細胞 3 次，將培養皿口朝下倒立于紙巾上數分鐘，偶爾拍打。用 Kimwipe 紙巾擦掉側壁上殘留的 PBS。 3. 加入 0.7 ml 含有 2~4 單位/ml RNase-IN (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) 的 HM，輕輕混旋培養皿以使 HM，能夠覆蓋培養皿的底面。 勻漿緩沖液（HM）： 10 mmol/L HEPES-KOH 緩沖液，pH 7.5 10 mmol/L KCl 1 mmol/L MgCl2 1 mmol/L DTT 0.5 mmol/L PMSF 4. 將培養皿取一定的角度，在 HM 中打濕橡皮或塑料淀帚，按同一方向將細胞從培養皿的一邊刮到另一邊。 5. 將刮取的細胞懸浮于 HM 中并集中到培養皿的一邊，打濕細胞淀帚以同樣的方法刮取培養皿其他部分的細胞，直到整個培養皿的細胞刮完（細胞刮走后培養皿的表面變得光滑)。用新鮮 HM 將玻璃吸管內表面打濕（見第 4 步），將細胞懸浮液轉移到一個小的緊密配套的 Dounce 勻漿器中（Kontes)。 6. 加 0.7 ml 新鮮 HM 到細胞已被刮掉的培養皿中，用細胞淀帚刮洗培養皿底部，將洗滌液轉移到另一培養皿中，用同樣的方法刮取細胞，將細胞懸浮液集中到 Dounce 勻漿器中。 7. 當兩到三個培養皿中的細胞懸浮液集中到一起以后，照下面的方法勻漿： (1) 以微小的角度握住 Dounce 勻漿器的管子立在桌子上。 (2) 慢慢將玻璃研杵插入，直到研杵的頭部與細胞懸浮液表面接觸，沿管子的一邊用力將研杵上下推動。 (3) 重復步驟 (2)，一上一下為一次共進行 15~20 次杵擊。 8. 細胞勻漿后立即用玻璃吸管將勻漿物轉移到一個試管中，并與 1/10 體積的 2.5 mol/L 蔗糖混合。 9. 重復 3~ 8 步，直到所有培養皿中的細胞被勻漿。 10. 測量勻漿物的體積。 11. 在 Sorvall HB-4 轉頭（700 g ) 中 2100 r/min 離心 3 分鐘，增加速度到 6500 r/min（7000 g)，再離心 10 分鐘。 12. 轉移上清（PMS）到一個刻度量筒中并加 0.9 體積的 2.5 mol/L 蔗糖以得到終濃度力 1.33 mol/L 的蔗糖-PMS 混合液，或者加 2.2 體積的 2.5 mol/L 蔗糖以得到終濃度為 1.8 mol/L 的蔗糖-PMS 混合液。 13. 在 SW41 轉頭離心管中準備下列分級梯度（從下到上）： 梯度 a： 1.5 ml 1.8 mol/L 的蔗糖-HM 1.5 ml 含 2~4 單位/ml RNase-IN 的 1.5 moI/L 蔗糖-HM 5 ml 蔗糖-PMS 混合物 1.5 ml 1.0 mol/L 的蔗糖-HM 1.5 ml 0.6 mol/L 的蔗糖-HM 1 ml 0.25 mol/L 的蔗糖-HM 梯度 b： 5 ml 蔗糖-PMS 混合物 1.5 ml 含 2~4 單位/ml RNase-IN 的 1.5 mol/L 蔗糖-HM 1.5 ml 含 2~4 單位/ml RNase-IN 的 1.3 mol/L 蔗糖-HM 1.5 ml 1.0 mol/L 的蔗糖-HM 1.5 ml 0.6 mol/L 的蔗糖-HM 1 ml 0.25 mol/L 的蔗糖-HM 14. 在 SW41 轉頭中 4℃ 41000 r/min ( 最大 286500 g ) 離心 16 小時（梯度a ) 或離心至少 5 小時（梯度b）。 15. 收集在 1.5 mol/L 和 1.8 mol/L 蔗糖層交界面形成的物質，這被認為是重粗微體部分。 16. 根據實驗目的用下列方法中的一種濃縮微體 (1) 為了獲得好的多聚核糖體分離圖譜 ① 用 0.1% SDS 溶液 100 倍稀釋一部分微體，測量 260 nm 和 280 nm 的吸收值。 ② 估計 100 μl 微體是否含有足夠多的核糖體來展示多聚核糖體在蔗糖密度梯度中的分布圖。 ③ 用 HM 5 倍稀釋樣品或 7 倍稀釋樣品，并用 SW41 轉頭在蔗糖線性密度梯度中進行分析。 (2) 為了收集沉淀 ① 用 HM 3 倍稀釋樣品或 5 倍稀釋樣品。 ② 根據樣品的體積在 Beckman Ti60 或 Ti50 轉頭中 40000 r/min ( 最大 160000 g) 離心 60~80 分鐘。 (3) 為了用于體外翻譯和重建實驗 ① 用含 RNase 抑制劑的 HM 3 倍稀釋樣品或 5 倍稀釋樣品。 ② 將稀釋的樣品加到 1.8 mol/L 蔗糖墊層溶液上，在 SW41 或 SW60 轉頭（轉頭的選擇取決于樣品的體積）中 35000 r/min ( 最大 210000 g）離心 60 分鐘。 ③ 收集在墊層溶液上部形成的微體膜條帶，如果有必要用 SW60 轉頭進一步濃縮到較小的體積中。 |
溶菌酶,全稱為1,4-β-N-溶菌酶,又稱粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶,屬于α-乳白蛋白家族。人們對溶菌酶的研究始于上世紀初,英國細菌學家Fleming發現人的唾液、眼淚中存在有溶解細菌細胞壁的酶,因其......
近日，中國科學院深圳先進技術研究院研究員喻學鋒、黃逸凡合作，建立二維材料等離子體液相制備新方法，相關研究成果以Intercalator-assistedplasma-liquidtechnology:......
......
根據文獻資料，肝微粒體的制備需要制備緩沖液，多使用超速離心法，其中微粒體蛋白含量測定可以用lowry法或考馬斯亮蘭法。在藥物的肝微粒體代謝研究中，往往需要加入氯化鎂或者EDTA。圖片來源于網絡測定苯胺......
為充分發揮國家土壤樣品制備與流轉中心（以下簡稱“制備中心”）作用，推進國家網土壤環境監測工作，中國環境監測總站（以下簡稱“總站”）組織6個制備中心開展2019年國家網土壤環境監測相關樣品流轉、制備與質......
一提到監測數據質量，大家都很自然地會想到監測人員身穿白大褂在潔凈的實驗室內進行化學分析的過程；一說到影響測定準確，就會想到試劑純度、儀器精度、方法檢出限、干擾因素及其消除方法等。其實，與復雜的高科技精......
近日，浙江大學物理學系和量子信息交叉研究中心研究員王大偉和教授王浩華聯合國內外多個相關團隊，首次在人工量子系統中合成了反對稱自旋交換作用，演示了利用手征自旋態制備量子糾纏的新方法。該成果于1月22日發......
國信招標集團股份有限公司受北京石墨烯研究院委托，根據《中華人民共和國政府采購法》等有關規定，現對北京石墨烯研究院2018年石墨烯晶元批量制備設備和高質量石墨烯薄膜批量制備設備采購項目進行公開招標，歡迎......
隨著高技術領域對高性能防護材料需求的不斷提高，現有防護材料（包括金屬材料、陶瓷材料和纖維復合材料等）的局限性（如金屬密度大、陶瓷脆性和纖維復合材料硬度低等）正逐漸顯現。最近，加州大學伯克利分校Robe......
根據透射電鏡的成像原理可知，電子束需要穿透試樣才能成像，這就要求被觀察的樣品對于入射電子束是“透明的”。電子束對薄膜樣品的穿透能力和加速電壓有關。當電子束的加速電壓為200kV時，就可以穿透厚度為50......
