3， 稍離心
4， 100℃沸水浴1分鐘
5， 趁熱加入Tag酶0.5ul（冰上操作）
6， 再加入50ul液體石蠟封閉
7， 10000rmp離心1分鐘
8， PCR條件
94℃ 1min
58℃ 50sec
72℃ 1min30sec
進行40個循環，然后72℃ 10min 完后4℃保溫。
9，10000rmp離心5min
10，將下層水相轉入新的0.65mlEP管中，-20℃保存。
電泳鑒定
一，準備工作
1，實驗器具與材料：
（1）移液槍：10ul
（2）吸頭：20ul
（3）吸頭臺：放置 200ul和20ul的吸頭一個
（4）三角燒瓶：50ml一個
（5）瓊脂糖
2，實驗器具的處理與準備
(1) 塑料制品：（包括吸頭等）
送至高壓3次，試驗前將槍頭放入吸頭臺。
（2）電泳板及電泳槽：
用自來水沖洗干凈備用
3, 試劑配制和準備：
(1) 電泳緩沖液（TAE）：
先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液：將37.2g EDTA-Na加入160ml蒸餾水中，在攪拌器上劇烈攪拌。在用NaOH調節溶液PH值至8.0（約需4gNaOH）。用蒸餾水定容至200ml。后送至高壓滅菌。室溫保存。
再配制50×TAE溶液：在400ml蒸餾水中溶解121g Tris堿，加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸餾水定容至500ml，室溫保存。
（2）瓊脂糖溶液（1.0％）：
50×TAE溶液取10ml，稀釋成500ml，取50ml溶解0.5g瓊脂糖，電爐上煮至沸騰，溶化的瓊脂物冷卻至60℃左右時加入10mg/ml EB 5ul，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的電泳板中，在室溫下放置45min左右后進行電泳。
（3）溴化乙錠（EB）（10mg/ml）：
在 20ml水中加入0.2g溴化乙錠，磁力攪拌數小時。然后用鋁箔包裹容器或將溶液轉移至棕色瓶中，室溫保存。
（4）加樣緩沖液（Loading Buffer）一般為6×Loading Buffer
二，電泳鑒定時注意事項：
佩戴一次性手套，避免皮膚接觸EB。無路做膠還是電泳緩沖液盡量用新的，不要超過兩周。
三，電泳步驟
1， 50×TAE取10ml稀釋成500ml，取50ml溶解0.5g瓊脂糖。電爐上煮沸后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入電泳槽中。
9， 用透明膠封閉電泳板，瓊脂糖溶液冷卻至溫熱時，倒入帶梳子的電泳板中，冷卻后，拔出梳子，放入電泳槽中。
10， 加樣：PCR Marker：1ul Marker＋1ul Loading Buffer＋4ul TAE混勻于塑料膜上，加入孔中。PCR樣品：5ul 樣品DNA＋1ul Loading Buffer 混勻后依次加入孔中。
11， 接上電源，電壓120V，電流50mA進行電泳。
12， 電泳約1小時后，紫外燈檢測。