代謝組學：一項艱巨的任務

　　學生化的孩子真是傷不起。糖代謝、脂代謝、核酸代謝，一系列代謝通路，一大堆代謝產物，簡直讓人頭暈眼花。然而，這又不能跳過。畢竟，DNA編碼蛋白質，而蛋白質在小分子上發揮其魔力。但很多時候，科學界對這些分子一無所知。

　　“如果你測定一滴血中的小分子，大約60% 所檢測到的峰都無法與任何代謝物相匹配，”華盛頓大學醫學院的助理教授Gary Patti談道。“因此，這是一個令人難以置信的信息寶藏。”

　　作為斯克里普斯研究所（Scripps Research Institute）的博士后，Patti發現證據，暗示大鼠的慢性疼痛模型中存在一種稱為N,N-dimethylsphingosine的代謝物，確定此過程為潛在的治療靶點1。

　　為了做到這一點，Patti和他的研究導師Gary Siuzdak攀上了組學樹上一個相對年輕的分支，代謝組學。 與基因組學和蛋白質組學相似，代謝組學試圖分類和量化生物體內的所有代謝物，這可是一項艱巨的任務。據美國北卡羅來納州一家代謝組學服務供應商 Metabolon的首席科學官Mike Milburn介紹，體內大約有2500-5000種小分子。代謝組學的研究人員通常利用質譜或核磁共振（NMR）來探索這些小分子。

　　Siuzdak和Patti利用質譜來研究大鼠模型中損傷部位周圍以及血液中的小分子。通過計算篩選那些圖譜，他們鑒定出豐度與表型（這個例子中是疼痛）相關的化合物。如果你也有意開展代謝物圖譜分析，請繼續往下讀。我們將介紹代謝組學領域的工具、技術和發展趨勢。

　　質譜工具

　　代謝組學研究中的兩大關鍵技術是質譜和核磁共振。據加州大學戴維斯分校的西海岸代謝組學中心主任 Oliver Fiehn介紹，質譜更受歡迎，這主要是因為樣品的復雜性。“質譜更容易與色譜結合使用。而NMR之前沒有分離，因此你最終會得到更加復雜的圖 譜，”Fiehn說。同時，NMR也不如質譜靈敏，但更為定量。

　　Fiehn介紹，在他自己的實驗室以及隔壁的核心實驗室，他的團隊先后使用過12臺質譜儀。這包括6臺氣相 色譜-質譜聯用儀（GC/MS），其中有3臺LECO的GC-TOF，1臺安捷倫的GC/Q-TOF和2臺安捷倫的四級桿GC/MS；以及6臺液相色譜 -質譜聯用儀（LC/MS），其中有2臺安捷倫的Q-TOF LC/MS，1臺賽默飛世爾的離子肼，1臺賽默飛世爾的LTQ FT-ICR，1臺AB SCIEX的LC-QTRAP和1臺LECO的LC高分辨率TOF。

　　每一臺儀器都有不同的長處和短處。Fiehn舉例說，GC-TOF靈敏又快速，但缺乏準確測定質量的能力，這使得它難以鑒定新穎的代謝物，特別是在發現模式（或無偏向，而不是針對性的）實驗中。

　　“在無偏向的代謝組學中，你看到了許多無法鑒定的信號，它們可能對某些疾病很重要，”Fiehn解釋道。“然后，你必須有一臺準確的儀器，因此我們使用安捷倫的LC-或GC-qTOF，它能夠準確測定質量。”

　　最近幾年，新的質譜儀也在不斷上市，以支持代謝組學的流程。

　　Waters公司的Synapt G2-S是一臺四級桿飛行質譜儀，特有離子淌度分離（IMS）能力。IMS是一種儀器內氣相分離策略，它能夠利用分子碰撞截面特性 （collisional cross-section）來分辨分子，甚至是化學性質相同（但構象不同）的分子。Waters負責藥物開發的主管James Langridge談道：“IMS是一種非常、非常強大的東西。如果你試圖鑒定一種未知的代謝物，碰撞截面提供了更大的特異性。”

　　據Langridge介紹，目前通過質譜儀主要開展三種類型的代謝組學研究：非靶向代謝組學 （untargeted metabolomics），它以無偏向的方式掃描代謝物，了解其豐度在某些情況下的變化；靶向代謝組學（targeted metabolomics），其中研究人員定量特定的已知代謝物；以及空間代謝組學（spatial metabolomics），它研究小分子在組織切片中的空間分布。

　　空間代謝組學是通過一項稱為“質譜成像”的應用實現的，它通過樣品內的光柵掃描來逐點收集光譜，以便從空間上確定代謝物位于組織中的何處。據Langridge介紹，MS成像通常是利用MALDI質譜儀完成的，MALDI Synapt G2-S可通過MALDI-HDI成像軟件實現這一應用。

　　賽默飛世爾也為代謝組學的研究人員提供了質譜儀。據該公司代謝組學的戰略營銷經理Yingying Huang介紹，Q Exactive四級桿 -Orbitrap質譜儀具有快的掃描速率（12 Hz），高的分辨率（高達140,000 FWHM）和高的質量準確度（1–3 ppm），適用于化合物的鑒定。

　　賽默飛世爾最近還推出了Exactive Plus質譜儀，它與Q Exactive有些相似，但沒有前面的四級桿，適用于代謝物的全面分析。Huang指出，如果需要，Exactive Plus儀器也能升級到Q Exactive。

　　據Huang介紹，Q Exactive能夠勝任代謝組學研究的所有三個階段 – 生物標志物發現、化合物鑒定和標志物驗證。當然，研究人員也可以購買專門的儀器。例如，賽默飛世爾的Orbitrap Velos Pro和Orbitrap Elite擅長化合物鑒定，這要歸功于它們的多種裂解策略和串聯能力。TSQ Vantage三重四級桿具有出色的檢測和定量能力，建議用于驗證實驗。

　　數據分析

　　從各方面來看，對代謝組學而言，難度不在于數據生成，而是數據分析。Langridge認為：“在我看來，代謝組學最大的挑戰，與其他組學學科相似，是在信息學的角度 – 如何解釋這些數據。”

　　代謝組的數量有成千上萬，而每個化合物可以通過幾個峰來表示。取其精華去其糟粕，自然需要復雜的分析工具。

　　據Milburn介紹，Metabolon每天大約運行300個樣品，從每個樣品中挑選并鑒定500-1000個代謝物。該公司已經開發出軟件，能夠自動在三個不同的質譜平臺上運行樣品，抽出峰值，決定哪些最有趣，并鑒定出它們所代表的分子。

　　許多質譜廠家也有自己的代謝組學平臺。

　　賽默飛世爾的SIEVE軟件是一種差異分析工具，能鑒定代謝組學實驗中變化最明顯的分子。不過它最有用的功 能之一是允許用戶校正溶劑背景，比如塑化劑，它常常在處理過程中滲入樣品，產生信號。Huang指出，在一個實驗中，大鼠血漿樣品的代謝組學分析產生了大 約20,000個離子信號。通過去除溶劑背景，系統將數量減少到7,000個，在分組到加合物和同位素時更進一步減少到540個。“這幫助我們大大降低假 陽性率，”她說。

　　如果你傾向于開源軟件，Siuzdak和Patti已經開發出一個在線的數據分析平臺，名叫XCMS -Online 2,3。任何人都可以創建一個賬戶，將他們的LC-MS數據上傳到XCMS-Online服務器，進行分析和查看。即使你沒有自己的數據，他們也提供一些 數據集示例供你查看，包括可口可樂和百事可樂。

　　XCMS-Online上的一個新工具是Cloud Plot interactive，它能夠比較兩個數據集，并圖示說明上調或下調，它們的倍數變化，以及這些變化的統計學意義。圖表還能鏈接到Siuzdak的 METLIN數據庫，它含有超過75,000種代謝化合物（其中11,000種包括質譜數據，是用手工精心收集的）。

　　據Patti介紹，他的實驗室已經開發出其他一些自動化的工具，能快速鑒定化合物。他希望很快能與XCMS-Online整合。“我們希望那些對代謝組學和信息學方法不太熟悉的研究人員也能開展這些實驗，”他說。“這確實是我們的目標。”

　　隨著代謝組學工具的不斷出現，相信越來越多的研究人員能夠實現這一目標。

　　參考文獻

　　1 G.J. Patti et al., “Metabolomics implicates altered sphingolipids in chronic pain of neuropathic origin,” Nature Chemical Biology, DOI： 10.1038/nchembio, 2012.

　　2 Tautenhahn, R, et al., “XCMS Online： A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data,” Analytical Chemistry, 84 (11), pp 5035–5039, DOI： 10.1021/ac300698c, 2012.

　　3 Tautenhahn, R, et al., “An accelerated workflow for untargeted metabolomics using the METLIN database,” Nature Biotechnology 30,826–828, doi：10.1038/nbt.2348, 2012.