【注意事項】
基因組DNA分子量大，所有操作必須輕柔，酚/氯仿對皮膚有腐蝕作用，應該戴手套操作。
二、RNA的制備
【實驗目的】
1.理解生物細胞中RNA制備方法的原理。
2.熟悉組織細胞中RNA制備的基本操作。
（一）細胞總RNA的提取
1.異硫氰酸胍法
【實驗原理】
異硫氰酸胍法提取細胞總RNA是目前常用的提取方法，其基本原理是：異硫氰酸胍 (GuSCN)是一種強的蛋白質變性劑，不僅能使細胞裂解，同時還能有效地抑制細胞內源性RNA酶的活性，通過有機溶劑的分步抽提，最終可獲得純度較高的細胞總RNA。
【實驗對象】
新鮮哺乳動物組織或細胞
【實驗試劑與器材】
（1）GuSCN緩沖液：
4 M異硫氰酸胍(GuSCN) ，25mmol/L 檸檬酸(pH7.0)，0.5% 十二烷基肌氨酸鈉（SLS）。配制方法：先稱取GuSCN加少量雙蒸水溶解，然后加入其余成分，65℃加熱使其充分溶解，4℃保存備用。
（2）GuSCN/25mmol/L β-巰基乙醇溶液：
將0.36ml β-巰基乙醇溶于200ml GuSCN緩沖中，4℃保存備用。
（3）2M NaAc (pH 4.0)
（4）0.1% DEPC-H2O：將0.1 ml DEPC加入100ml雙蒸水中，室溫搖晃12~24小時，然后15磅高壓15min（注意：若用此水處理容器，可以不用高壓處理）
（5）氯仿:異戊醇 (49:1, v/v)
（6）DEPC-H2O飽和酚：
將DEPC-H2O和酚1:1混合，室溫搖晃1小時，然后靜止使其分層，吸除水相，再加入DEPC-H2O重復一次，此即DEPC-H2O飽和酚。
（7） 無水乙醇
（8） 75%冰冷乙醇
【實驗方法與步驟】
（1）取離心洗滌后的1×106培養細胞或相當量的研磨后的組織，加入200?滋 l GuSCN/25mM）-巰基乙醇溶液，劇烈震蕩使細胞裂解，此時溶液變黏稠；
（2）加入下列成分：2M NaAc (pH4.0) 25?滋l，DEPC-H2O飽和酚240?滋l，氯仿:異戊醇 (49:1,v/v) 50?滋l，劇烈震蕩10秒鐘，冰浴15min；
（3）4℃，10,000×g離心30min，使其充分分層，水相應透明無任何混濁 [注：RNA在上 層水相，DNA和蛋白質在中間相和酚相中]；
（4）將上層水相轉移至另一離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀 30min，4℃，10,000×g離心20min；
（5）棄上清，加入100?滋l GuSCN緩沖液將RNA沉淀溶解，然后加入200?滋l無水乙醇，-20℃沉淀30min，4℃，10,000×g離心20min；
（6）棄上清，用75?滋l DEPC-H2O溶解RNA沉淀，加入7.5?滋l 2M NaAc (pH4.0)，165?滋l無水乙醇，-20℃沉淀30min，4℃，10,000×g離心20min；
（7）棄上清，加入75%乙醇(-20℃)1ml，不要混合，4℃，7500×g 離心10min；
（8）棄上清，室溫自然干燥RNA沉淀 (注意：RNA沉淀不能過分干燥，否則將無法使其溶解)；
（9） 用DEPC-H2O溶解RNA備用。若長期保存，應將RNA懸于75%乙醇中置-20℃。
【注意事項】
1.所有試劑均用DEPC-H2O配制；操作中要防止RNA酶的污染，必須戴手套，戴口罩，玻璃器皿可在烤箱中180℃烘烤2h，滅活RNA酶，或者用新的。
2.Trizol試劑法：原理、試劑、器材.
用Trizol試劑(美國Gibco公司產品)在室溫下可提取RNA、DNA及蛋白質，具有快速方便、提取量大等優點。
【實驗方法與步驟】
（1）0.5~1×107 細胞或相當量的組織，用1ml Trizol試劑裂解細胞，搖動混合后室溫孵育5~10min；
（2）加入2氯仿，震蕩混勻15秒，置室溫2～3min；
（3）10,000×g，4℃離心15min，將水相移至另一離心管中，加入 0.5ml異丙醇，混合后室溫沉淀10min，10000×g離心10min；
（4）棄上清，加入1ml 75%乙醇，不混合，7500×g離心10min；
（5）棄上清，室溫下空氣蒸發殘存的乙醇。
3.Oligo(dT)纖維素層析法提取mRNA
【實驗原理】
真核細胞的3’端有poly(A)尾，因此可用Oligo(dT)纖維素結合 mRNA，從而將mRNA從總RNA中分離出來。Oligo(dT)纖維素就是將Oligo(dT)15～18結合到纖維素上，制備成能特異性結合帶 Poly(A)尾RNA的纖維素。
