體外DNA重組技術5

（三）DNA酶切片段的回收

【實驗方法與步驟】

1.凍融法:

（1）在UV燈下，用手術刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，-70℃冷凍至少 15min，然后在65℃水浴中使膠融化；

（2）加入等倍體積TE-飽和酚，劇烈振蕩30秒鐘，然后-70℃冷凍 15min；

（3）室溫融化后，12,000rpm離心5min，將上層水相移至另一離心管中，用2.5倍體積乙醇和0.1倍體積3mol/L NaAc(pH5.2)沉淀DNA片段，離心后的沉淀用75%乙醇漂洗一次，室溫干燥DNA，用雙蒸水或TE緩沖液溶解DNA后，-20℃保存備用。

2.低熔點瓊脂糖法:

（1）在UV燈下，用手術刀片在待回收DNA片段前方挖一槽，然后用同樣濃度的低溶點瓊脂糖將槽填平，繼續電泳至待回收DNA片段進入低熔點瓊脂糖中；

（2）在UV燈下，用手術刀片將含DNA的低熔點瓊脂糖凝膠切下，37℃水浴 10min至凝膠融化為止；

（3）加入等體積的TE飽和酚/氯仿(1:1)抽提，12000rpm離心 5min；

（4）將上層水相移至另一離心管中，用2.5倍體積乙醇和0.1倍體積 3mol/L NaAc(pH5.2)沉出、75%乙醇漂洗一次，晾干備用。

3.DNA回收試劑盒（玻璃乳法）:

（1）在UV燈下，從瓊脂糖凝膠上切下含DNA片段的凝膠，放入一離心管中；

（2）加入3倍體積的6mol/L NaI溶液，45～55℃水浴5～10min使膠完全融化；

（3）加入10?滋l玻璃乳懸液，輕彈管底混勻，然后45～55℃水浴 5～10min，期間每2～3min混勻一次；

（4）5000rpm離心30~60秒，棄上清；

（5)加400?滋l漂洗液（20mM Tris.Cl，pH7.4/1mM EDTA/100mM NaCl和等體積無水乙醇），輕彈管底混勻，然后同上離心棄上清；

（6）再加入漂洗液，輕彈管底混勻，然后同上離心棄上清，并用加樣器盡量除凈漂洗液，然后室溫晾干；

（7）加10~30?滋l無菌雙蒸水或TE緩沖液將玻璃乳懸浮起來，45～55℃ 水浴5～10min；

（8）10000rpm離心1～2min，回收上清備用。

【注意事項】

漂洗玻璃毛時不可用加樣器上下吹打，從玻璃毛上洗脫DNA時則相反。

五、載體與DNA片段的連接反應

【實驗目的】

學習和掌握DNA連接酶的使用原則和基本方法

【實驗原理】

DNA連接酶可以在兩個雙鏈DNA分子相鄰的5'-磷酸與3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵，從而可以實現重組DNA分子的構建。一般在連接反應之前，DNA分子都要進行限制性內切酶消化，使待重組的DNA分子具有相匹配的末端，黏性末端連接和平齊末端連接是最常用的，但不匹配的末端也可以經過修飾實現連接。
下面以質粒DNA為載體，介紹目的DNA片段與載體的連接。

黏性末端的連接涉及三種情況：①載體和DNA片段經雙酶切后，兩端具有不同的粘端，可以直接進行連接反應。②載體和DNA片段單酶切后，在DNA片段兩端是互補的粘端。DNA片段插入載體時具有正反兩個方向。③平齊末端連接需要在 DNA5'-端去磷酸化，否則線性載體DNA分子將發生自身環化連接。

（一）5'-端去磷酸化反應

通常只對載體DNA分子進行5'-端去磷酸化反應就基本可以避免自身環化連接。

【實驗試劑與器材】

1.小牛腸磷酸酶 (Calf intestine phosphatase ,CIP)

2.10×CIP緩沖液

【實驗方法與步驟】

1.酶切DNA反應，在75℃加熱15min滅活酶活性；

2.10×CIP緩沖液和1U CIP，混合后，37℃孵育30～60min，然后75℃加熱15min滅活CIP活性；

3.瓊脂糖凝膠電泳分離并純化目的DNA片段用于連接反應。

（二）連接反應

【實驗試劑與器材】

1.T4 DNA連接酶

2.10×T4連接酶緩沖液

【實驗方法與步驟】

反應體系：

質粒DNA (0.5(g/?滋l) 2?滋l

DNA插入片段(300ng/?滋l) 5?滋l

10× 連接緩沖液 1?滋l

T4 DNA連接酶 1?滋l

加水至總體積 10ul

混合后置14～16℃水浴6～12h。

【注意事項】

1）通常DNA插入片段與載體DNA的摩爾比為3:1或2:1，需根據DNA分子量計算，而不取決于濃度；2）平齊末端連接時，插入片段的量要遠遠大于載體DNA的量，可以為5:1或更多，即使這樣，連接效率仍然很低。3）有時DNA 一端是粘端，另一端是平端，這種連接與雙酶切粘端連接相似；4）不匹配末端需要連接時，首先要將末端處理成平端，然后再進行連接反應。