①階段光合磷酸化實驗
指光合磷酸化可以相對分成照光階段和暗階段來進行,照光不向葉綠體懸浮液中加磷酸化底物,而斷光時再加入底物能形成ATP的實驗。1962年,中國的沈允鋼等人,用此實驗探測到光合磷酸化高能態(Z*)的存在。1963年賈格道夫(Jagendorf)等也觀察到了光合磷酸化高能態的存在。起初認為Z*是一種化學物質,以此提出了光合磷酸化中間物學說。知道高能態即為膜內外的H+電化學勢。所謂兩階段光合磷酸化,其實質是光下類囊體膜上進行電子傳遞產生了跨膜的H+電化學勢,暗中利用H+電化學勢將加入的ADP與Pi合成ATP。
②酸-堿磷酸化實驗
賈格道夫等(1963)在暗中把葉綠體的類囊體放在pH4的弱酸性溶液中平衡,讓類囊體膜腔的pH下降至4(圖4-16A),然后加進pH8和含有ADP和Pi的緩沖溶液(圖4-16B),這樣瞬間的pH變化使得類囊體膜內外之間產生一個H+梯度。這個H+梯度能使ADP與Pi生成ATP,而這時并不照光,也沒有電子傳遞。這種驅動ATP合成的類囊體內外的pH差在活體中正是由光合電子傳遞和H+轉運所形成的。這一酸-堿磷酸化實驗給化學滲透假說以最重要的支持證據。
③光下類囊體吸收質子的實驗
對無pH緩沖液的葉綠體懸浮液照光,用pH計可測到懸浮液的pH升高。這是由于光合電子傳遞引起了懸浮液中質子向類囊體膜腔運輸,使得膜內H+濃度高而膜外較低的緣故。電子傳遞產生了質子梯度后,質子就有反向跨膜轉移的趨向,質子反向轉移時,質子梯度所貯藏的能量就被用去合成ATP(圖4-15)。
以上實驗都證實了米切爾的化學滲透學說的正確性,因而米切爾獲得了1978年度的諾貝爾化學獎。