體外合成的蛋白質對于測定一個克隆的基因是否編碼一個特異的DNA結合蛋白， 以及分析DNA-蛋白質相互作用都是極為有用的。為了檢測DNA的結合能力，可將標 記的蛋白質與特異的DNA片段共溫育，用非變性丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質-DNA復 合物與游離的蛋白質分離開來。來源：《精編分子生物學實驗指南》第五版
| 實驗材料 | |
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| 試劑、試劑盒 | 35S標記的蛋白5×結合緩沖液10 mg mL poly (dl-dC) ? poly (dl-dC)或其他的大分子載體 DNA加樣緩沖液45%甲醇 10%乙酸EN3HANCE (Du Pont NEN) |
| 實驗步驟 | 1) 用合適的限制性內切核酸酶切割0.5μg含有結合位點的質粒DNA (假設一個5 kb 的質粒），產生一個長為150?700 bp的片段，這個片段的大小和內切酶切出的其他片段的大小不同。用酚抽提及乙醇沉淀純化。 2) 建立以下15μL的結合反應： 5μL H2O 3μL5×結合緩沖液 5μL DNA (DNA 片段各 9 nmol/L) 1μL 10 mg/mL poly (dl-dC) . poly (dl-dC) 1μL35S標記的蛋白 室溫下溫育20 min。 設立不含有DNA及含有非特異性DNA (即缺乏結合位點）的對照反應。 3) 加5μL加樣緩沖液，立刻加樣到5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上。進行電泳，直至溴酚藍接近膠的底部（根據緩沖液條件，大約需要1?4 h),不要讓膠的溫度高于室溫。 膠的組成及緩沖液的離子強度可作改變，并且這些改變對于檢測蛋白質-DNA的相互作用可能很重要。 4) 電泳結束后，將凝膠置于45%甲醇/10%乙酸中室溫下固定1 h。用EN3HANCE處理膠1 h，干膠，然后進行放射自顯影。 |
| 注意事項 | |
| 其他 | 與更為常用的遷移率變動分析法中采用32P 標記的DNA及不標記的蛋白質有所不同，這里介紹的分析方法一般用的是35S標記的蛋白質與不標記的DNA。這個方法的主要優點是：任何突變蛋白質只要改變DNA模板就可以測定其DNA結合性質，并且可以檢測其亞單位結構（如二聚體、四聚體） |