克隆的篩選和快速鑒定

實驗概要

掌握快速細胞破碎法測定大小不等的眾多的質粒DNA；和菌落PCR快速鑒定克隆。

實驗原理

在這個實驗方法中，只需配制一種細胞緩沖液（它可以在室溫下保存，長期使用）。利用破碎細胞緩沖液中的陰離子去污劑---SDS在37℃溶解膜蛋白，使細胞破裂，并解聚核蛋白，SDS還能與蛋白質結合形成復合物，使得蛋白質沉淀。利用EDTA螯合金屬離子，防止破碎細胞的脫氧核糖核酸酶對DNA的降解。然后高速離心，去除細胞碎片核大部分的染色體DNA和RNA蛋白，將含有質粒DNA的上清夜直接進行點樣電泳和分離。在瓊脂糖凝膠上分離開的個組分中，有染色體DNA，不同大小的質粒DNA和RNA，它們都可以經肉眼觀察或拍照顯示。
  或者用設計好的引物，做菌落PCR快速鑒定克隆。  

主要試劑

1、破碎細胞緩沖液 50mmol/L Tris-HCl (pH6.8) 1% SDS 2mmol/L EDTA 400mmol/L蔗糖 0.01%溴酚藍 配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8)         10毫升           20%    SDS                  10毫升           250mmol/L EDTA              1.6毫升            蔗糖                         27.2克            1.2%溴酚藍                  1.67毫升            加ddH2O至200毫升
  2、10mg/ml 溴乙啶 3、TBE電泳緩沖液（5×） 4、Taq DNA聚合酶 5、10×反應緩沖液（含25mmol MgCl2） 6、dNTP 7、點樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍，40%甘油。  

主要設備

1、電泳儀 2、1.5ml 離心管 3、Tip  4、培養皿 5、PCR擴增儀 7、臺式離心機 8、紫外分析儀 9、恒溫水浴  

實驗步驟

一、快速細胞破碎法測定 1、取1.5ml離心管編號碼，每管加入50ul破碎細胞緩沖液。 2、取一培養皿在底部標記如圖所示 3、待轉化的細菌菌落長到2mm時 4、用牙簽挑取單克隆將菌落點在作好標記的方格內，然后將牙簽加入對應的培養管中（培養管中含5ml LB液體培養基）。 5、培養皿37℃×6 h后4℃保存。培養管37℃×12 h左右。 6、用培養管中的菌液提取質粒。 7、酶切電泳檢查質粒。
  二、菌落PCR快速鑒定法 1、直接用牙簽或接種針挑取少許菌體加入25ul或50ul PCR反應體系中。 2、用通用引物或特異引物進行PCR，根據擴增條帶的有無和大小來判斷插入片段的有無、大小及方向（反應體系參照前面實驗）。