酶切
直接在回收PCR產物的試管中配置酶切體系：
PCR產物酶切－制作插入片斷
公用Buffer 6μL
酶 I 3μL
酶 II 3μL
PCR產物 ——
雙蒸水 48μL
合計 60μL
要將PCR產物接入的質粒載體A，取A質粒3μL進行酶切。
A質粒酶切－制作載體片斷
公用Buffer 3μL
酶 I 1μL
酶 II 1μL
質粒 3μL
雙蒸水 22μL
合計 30μL
混勻
37℃，酶切3小時。
1%瓊脂糖回收膠回收（碎膠、酚氯仿抽提法）
1. 酶切產物加入10％量的上樣Buffer，混勻。使用1%的瓊脂糖回收膠，電泳回收酶切產物。
2. 用手術刀切下所需要的大片斷（載體）和小片斷（插入片斷），收入一個1.5mL離心管中。 （提示 切膠前，需用分別含酒精、NaOH和雙蒸水的紙巾擦拭凝膠接觸的臺面，以防污染。 手術刀要火焰消毒，而后切膠回收。）
3. 12000rpm 1分鐘，將凝膠甩到管底。 -20℃ 冰凍20分鐘。
4. 取200μL Tip 頭兩只，在酒精燈上稍烤化Tip頭尖端，兩Tip頭尖相對來回相接觸，在Tip頭頂部制成直徑3mm左右的平頭，準備用于碎膠。
5. 從-20℃取出凍結的凝膠，立即使用200μL槍套上平頭Tip頭，搗碎凝膠。（提示 200μL的槍足夠粗壯，不要用100μL的槍，小心折斷！！！ 乘凝膠比較硬時就開始碎膠，輕而頻率高地搗碎凝膠）
6. 凝膠管中加入500μL雙蒸水，蓋緊，振搖200下。
7. 加入500μL Tris飽和純酚，蓋緊，振搖200下。 12000rpm 4℃ 離心15分鐘。
8. 在一新1.5mL 離心管中加入 500μL 氯仿：異戊醇（24：1），將步驟7的上清加入本步驟離心管中。蓋緊，振搖200下。 12000rpm 4℃ 離心5分鐘。