前言
化學發光技術已經成為當前免疫診斷市場中最重要的檢測技術。自上世紀70年代誕生以來，盡管隨著檢測設備全自動化水平以及檢測元件精密度、試劑生產保存工藝的發展，化學發光技術的檢測靈敏度有了顯著的提升，然而究其本質而言，無論是酶促發光、直接發光或是電化學發光，化學發光技術在檢測原理上在過去的近50年里并沒有得到任何改變。可以認為在自動化水平已經達到相當高程度的今天，化學發光技術在現有抗體親和力水平的前提下，已經接近了其檢測能力的極限。
免疫診斷市場在新型標志物或新型診斷市場上的開拓，可能需要一種從檢測原理層面進行變革的新型免疫診斷技術——單分子免疫檢測。
本文將分為以下幾個部分探討下一代免疫診斷技術——單分子免疫檢測對現有免疫診斷市場的影響以及在體外診斷市場普及應用的可行性。
上篇我們介紹了以下內容:
（1） 化學發光發展現狀
（2） 單分子檢測技術——生物檢測技術的極限標尺
（3） 從化學發光到單分子免疫檢測有多遠
（4） 數字PCR技術的發展給單分子免疫檢測的啟示
下篇聊聊以下部分：
（5） 單分子免疫檢測技術發展現狀
（6） 單分子免疫檢測平臺技術分析
（7） 單分子檢測技術是分子檢測與免疫檢測平臺統一化的可行橋梁
（8） 超低成本單分子免疫檢測技術實現的可能性
5. 分子免疫檢測技術發展現狀
單分子免疫檢測是指通過免疫標記的方法，利用抗體捕獲和識別抗原，進行信號分子標記或是酶聯標記的形式，通過單分子熒光信號檢測或單分子酶促反應實現的單分子級別蛋白分子的檢測，其檢測靈敏度遠超現有的化學發光技術平臺。
目前全球范圍內，已商品化的單分子級別免疫檢測的技術平臺僅有Quanterix公司的SiMoA系統和Merck的SMC系統。
美國Quanterix公司的創始人是David Walt，他是美國塔夫茨大學化學系的教授，不僅是美國國家科學院和工程院的雙料院士，還是基因測序龍頭企業Illumina公司的創始人。
2007年，David Walt在美國馬薩諸塞州創立了公司QuanterixCorporation，首次推出SiMoA技術。
2013年該公司上市了科研系列產品——基于SiMoA技術的檢測設備。
2015年推出第二代基于SiMoA技術的檢測設備，并于該年取得1000多萬美元銷售額。
2017年，公司實現超過2000萬美元的銷售收入。
SiMoA（Single Molecule Array）系統源自于DavidWalt與David Duffy的團隊開發的一套“DigitalELISA”檢測系統。其檢測原理與數字PCR近似，都是通過微反應器單元進行單分子隔離結合單分子水平信號放大來實現的。
SiMoA系統通過免疫反應將磁珠捕獲的抗原分子使用半乳糖苷酶標記，再將其分散到微米尺度的微孔陣列中，通過使用油相進行物理上的隔絕，讓微孔中單分子半乳糖苷酶進行酶促反應，產生熒光信號。其檢測端與數字PCR相同，使用“0”與“1”對根據微孔熒光強度進行標記，通過“1”和“0”的計數和占比分析實現單分子計數以及超高靈敏度的蛋白檢測分析。
表2 Quanterix Corp融資歷史
由于SiMoA技術遠遠領先于現有的各類免疫診斷技術，其單分子水平的檢測能力更是被認為“將改變整個蛋白標志物檢測市場游戲規則”，因而深受資本市場的認可。
Quanterix公司的融資歷史如表2所示，公司于D輪獲得了5450萬美元的融資，其中包括了國內企業樂普醫療通過樂普-民和全球精準醫療創新投資基金增資的1100萬美元，用于公司IVD產品的開發注冊與推廣。公司于2017年末在納斯達克上市。
SiMoA系統的出現，徹底打破了免疫診斷市場中，現有的檢測技術在檢測能力或檢測靈敏度水平的極限，使得單分子蛋白檢測成為了可能。受限于SiMoA復雜的操作流程以及難以控制的高昂試劑耗材制造成本，盡管Quanterix公司2016、2017年已實現1758.50萬美元、2287.40萬美元的營業收入，其虧損額度卻高達2317.3萬美元和2701.9萬美元。
但是，這依然不能阻礙SiMoA系統所代表的單分子免疫檢測技術成為近幾年海外在免疫檢測技術當中最趨之若鶩的方向。
繼SiMoA系統之后，Merck公司主推的SMC（SingleMolecule Counting）系統最早由Singulex公司開發，于2015年由MerckLife Technology收購其生命科學領域的使用權。Erenna系統是SMC第一代單分子檢測設備，該設備通過流式分子掃描檢測的方法，實現分子計數功能。
由于受限于Erenna設備的制造成本和穩定性問題，2018年初，Merck公司推出了第二代單分子免疫檢測設備SMCxPRO。SMCxPRO于2018年5月前后在國內市場開始推廣，國內單臺設備售價超過20萬美元，96人份·的試劑盒市場售價均超過2000美元，研發用試劑盒更是高達6000美元（30test）。截至目前為止，該設備國內銷量已超過6臺。
與SiMoA技術使用的單分子酶催化信號放大策略不同，SMC技術采用更為直接的設備依賴型單分子檢測方法。SMC系統中，將激光聚焦到光學極限尺度范圍內，使得微米尺度的聚焦光斑范圍內的激發光源能量達到一個極高程度。在這個光斑中，通過免疫反應標記的單個或數個熒光染料分子將釋放出足夠多的光子以確保被PMT檢測到，實現單個分子的計數功能。
繼SiMoA系統之后，SMC系統再次讓單分子免疫檢測技術進入相關領域的視野，進一步引發業內人員對下一代免疫診斷技術的思考。
6. 單分子免疫檢測平臺技術分析
6.1 SiMoA系統
圖3 SiMoA操作流程示意圖
圖4 SiMoA HD-1 Analyzer設備圖
SiMoA通過磁珠酶聯免疫反應與微孔陣列芯片的結合，實現單分子蛋白檢測。其操作流程如下：
（1）利用表面標記有捕獲抗體的磁珠捕獲樣品中的抗原；
（2）使用biotin標記的檢測抗體對被捕獲的抗原進行標記；
（3）加入鏈霉親和素——半乳糖苷酶復合物，與檢測抗體上的biotin結合；
（4）將反應洗凈后的磁珠與底物混合，加載到含有微孔陣列的檢測芯片中，利用磁場使磁珠落入與其尺寸完全匹配的微孔中（3μm左右），加入油相，使得微孔之間物理隔離；
（5）含有半乳糖苷酶的微孔由于酶分子催化底物產生熒光產物；
（6）對微孔陣列進行熒光成像，通過對發出熒光信號的微孔個數對照標準曲線來實現定量檢測。