免疫印跡試驗（westernblot）異常結果分析

蛋白質印跡是一種非常適用于蛋白質檢測的技術，因為它允許用戶量化蛋白質表達。本文主要介紹一些該技術結果異常的排除方法。因為研究人員試圖獲得一種非特異性但強烈的信號，蛋白質印跡可以被視為一種錯綜復雜的平衡。

即使蛋白質印跡的程序很簡單，也會出現許多問題，導致意想不到的結果。該問題可分為五類：（1）異常或意外的條帶，（2）無條帶，（3）微弱條帶或弱信號，（4）印跡背景高，（5）斑點或不均勻斑點污點。

不尋常或意外的條帶可能是由于蛋白酶降解，其在意外位置產生條帶。在這種情況下，建議使用保存在冰上或改變抗體的新鮮樣品。如果蛋白質位置太高，那么重新加熱樣品可以幫助打破四元蛋白質結構。類似地，模糊帶通常由轉移期間存在的高壓或氣泡引起。在這種情況下，應確保凝膠在較低電壓下運行，并且適當地制備轉移夾層。此外，更改運行緩沖區也可以解決問題。由于低阻力，非平坦帶可能是由于穿過凝膠的過快而導致的。為了解決這個問題，應優化凝膠以適合樣品。

另一個問題：由于與使用的抗體，抗原或緩沖液有關的許多原因，也不會出現條帶。如果使用不正確的抗體，無論是原發還是繼發，該頻段都不會顯示。此外，抗體的濃度也應該是合適的。如果濃度太低，信號可能不可見。重要的是要記住一些抗體不能用于蛋白質印跡。沒有可見條帶的另一個原因是抗原濃度最低或不存在。在這種情況下，來自另一來源的抗原可用于確認問題是在于樣品還是與其他元素如抗體有關。此外，長時間洗滌也會降低信號。緩沖區也可能導致問題。應該確保緩沖區，如轉移緩沖區，TBST，運行緩沖區和ECL都是新的和非污染的。如果緩沖液被疊氮化鈉污染，它可以使HRP失活。

同樣，弱信號可由低濃度的抗體或抗原引起。增加曝光時間也有助于使頻段更清晰。另一個原因可能是脫脂奶粉掩蓋了抗原。在這種情況下，使用BSA或減少使用的牛奶量。

高背景通常由過高濃度的抗體引起，其可以與PVDF膜結合。另一個問題可能是緩沖區太舊了。增加洗滌時間也有助于減少背景。太高的曝光也會導致這個問題。因此，建議檢查不同的曝光時間以獲得最佳時間。

印跡上的斑點和不均勻斑點通常是由于轉移不當引起的。如果凝膠和膜之間夾有氣泡，則膜上會顯得更暗。使用振蕩器進行所有孵育也很重要，因此在孵育期間不會出現不均勻的攪動。再一次，洗滌對洗滌背景也是至關重要的。這個問題也可以由與阻斷劑結合的抗體引起; 在這種情況下，應該嘗試另一種阻止劑。過濾封閉劑也有助于去除一些污染物。最后，這個問題也可能是由二抗的聚集引起的。在這種情況下，應將二抗離心并過濾以除去聚集的抗體。