免疫球蛋白純化技術

血清

生理鹽水 硫酸銨溶液 萘氏試劑 磷酸鹽緩沖鹽液 磺基水楊酸

冰箱 離心機 攪拌器 紫外分光光度計 扭力天平 粗天平 透析袋 尼龍繩 竹棒、PH試紙 鑷子 剪刀 燒杯 量筒 吸管 滴管 滅菌小瓶 試管

1.  取正常人混合血清加等量生理鹽水，于攪拌下逐滴加入與稀釋血清等量的飽和硫酸銨[終濃度為50 ％飽和（NH_4）2SO₄]，4 ℃，3 小時以上，使其充分沉淀

2.  離心（3000 rpm）， 20 分鐘，棄上清，以生理鹽水溶解沉淀至X ml。再逐滴加飽和硫酸銨X/2 ml，置4 ℃，3 小時以上［此時（NH_4）2SO₄的飽和度為33 ％)］

3.  重復上述第二步過程多次。將末次離心后所得沉淀物以0.02 M PH7.4 PBS溶解至X ml裝入透析袋。對PBS充分透析、除鹽換液3次，至萘氏試劑測透析外液為無黃色

4.  將透析袋內樣品取少許作適當倍數稀釋后，以751-G紫外分光光計測蛋白含量。

方法如下

蛋白含量（mg/ml）＝（1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm）×樣品稀釋度。

注：式中1.45與0.74為常數，nm為波長。

一、影響鹽析的因素

1.  蛋白質的濃度

鹽析時，溶液中蛋白質的濃度對沉淀有雙重影響，既可影響蛋白質沉淀極限，又可影響蛋白質的共沉作用。蛋白質濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低，但雜蛋白的共沉作用也隨之增加，從而影響蛋白質的純化。故常將血清以生理鹽水作對倍稀釋后再鹽析。
 

2.  離子強度

各種蛋白質的沉淀要求不同的離子強度。例如當硫酸銨飽和度不同，析出的成分就不同，飽和度為50 ％時，少量白蛋白及大多數擬球蛋白析出；飽和度為33 ％時γ球蛋白析出。
 

3.  鹽的性質

最有效的鹽是多電荷陰離子。
 

4.  PH值

一般說來，蛋白質所帶凈電荷越多，它的溶解度越大。改變PH改變蛋白質的帶電性質，也就改變了蛋白質的溶解度。

5.  溫度

鹽析時溫度要求并不嚴格，一般可在室溫下操作。血清蛋白于25 ℃時較0 ℃更易析出。但對溫度敏感的蛋白質，則應于低溫下鹽析。
 

6.  蛋白質沉淀后宜在4 ℃放3 小時以上或過夜，以形成較大沉淀而易于分離。