免疫組化實驗原理

    首先來談一下免疫組織化學（IHC, Immunohistochemistry）、免疫細胞化學（ICC, Immunocytochemistry）和免疫熒光(IF, immunofluorescence technic )的共通之處和區別。

    平常說的 免疫組化 就是用石蠟切片做的免疫組織化學，樣品是經過甲醇或甲醛固定后脫水包埋得到的組織切片。加入一抗二抗，經DAB底物顯色，用普通的顯微鏡觀察信號分布和強度。專業一點，免疫組化包括免疫組織化學和免疫細胞化學，即IHC和ICC。ICC與IHC的區別在于樣品的不同，ICC的樣品是細胞（提前制作的細胞爬片），并且常用熒光染色檢測，也可以用酶聯抗體顯色，最后分別用熒光顯微鏡和普通光學顯微鏡觀察和拍照。IF技術所用的樣品范圍廣，可以用石蠟切片、冰凍切片，也可以用細胞爬片。而IHC多用石蠟切片，因為石蠟切片能保持完整的組織型態和蛋白表達位置，樣本可大可小。冰凍切片由于不需要經過固定、脫水和修復等過程，蛋白的結構保持地更好一些，步驟也更簡單快捷，是術中病理診斷的常用技術。用IF做ICC和冰凍切片的染色，過程類似。

IHC、ICC和IF的原理有相似之處，本質上都是利用了抗原抗體的特異性結合。IHC和ICC中的“化學”，顧名思義，是通過化學反應顯色。IF中的“熒光”是通過熒光基團被相應的激發光激發而發光，從而被檢測到。不同之處在于，IHC和ICC是通過在二抗上偶聯HRP（辣根過氧化物酶），以過氧化氫為底物，產生游離氧，后者使無色的供氫體DAB氧化為棕褐色沉淀定位于過氧化物酶所在部位。而IF則是在二抗上偶聯熒光基團，在相應波長的激光激發下而發出熒光（是熒光染料的特性）。因此，前者用普通的光學顯微鏡即可觀察到，而后者需要用熒光顯微鏡。可以根據自己的實驗目的去選擇不同的顯微鏡，如果只是簡單的定位，要求可以低一些，如果需要做準確一點的定位和定量，需要更高分辨率的顯微鏡。

    我的課題做IHC和多標（mIHC）較多，故而，我會對IHC的講解更加細致一些。

    肝臟組織固定收其中的兩個中等大小的肝葉，用4%多聚甲醛的固定過夜（16~18h）。甲醛使組織中的蛋白交聯，將組織形態固定住，同時使組織更致密且硬度增大。1xPBS洗三遍之后進行脫水，從75%EtOH開始，一般2~3h即可，如果當天來不及脫水（全程約10h），便可以在75%乙醇中過夜，甚至放一周也沒問題。從75%-85%-95%-100%EtOH梯度脫水，是為了防止組織快速收縮，改變了組織形態，使得信號不容易被檢測到。由于最后要用石蠟包埋，且組織內部和周邊的石蠟最好達到均質的狀態，才會利于切出完整的組織切片，而且100%乙醇與石蠟不互溶，二甲苯是石蠟的溶劑，所以不能直接通過乙醇直接浸入石蠟，而需要用二甲苯替換出組織中的無水乙醇，最后浸入石蠟中過夜，讓石蠟充分進入組織。切片時選擇5um的厚度，37℃展片和烘片。其實不必執著于時間，展片的標準應該是切片完全展開沒有褶皺，并且石蠟不能融化，注意貼片時的手法，一般來說沒有什么問題。烘片的目的是讓組織與玻片完整貼合固定，并且烘干表面和周圍的水，一般來說過夜后第二天收起來就可以了，四度保存。

    下面說一下IHC染色的問題。

    做過IHC的朋友都知道，這個實驗很耗時間，一做就是兩天，其中大部分時間都是零零散散，最重要的工作莫過于等待。個人認為做IHC的關鍵點在于：洗干凈和二抗的孵育時間。如果洗不干凈或者二抗孵育時間過長，肯定會造成非特異性染色，也就是背景，導致染色質量很差，甚至忙活幾天都不能拿到具有分析價值的結果。我們做肝臟切片，用5%NGS（normal goat serum）封閉時間可以長一些（如果中間有事情），但最少一個小時。二抗的孵育時間是30min，AB complex（avidin+biotin）的孵育時間也是30min。由于二抗和avidin孵育時間長的情況下，會有非特異性染色，具體的原理，在后面介紹avidin+biotin的時候再細講。我們實驗室是固定DAB的顯色時間是5min，根據信號強度來調整一抗的濃度。當然也可以摸DAB的顯色時間，但個人覺得不太好把控。因為抗體的適合濃度是一個較大的范圍，而DAB的顯色時間很短。

    用單蒸水和1xTBST洗片子最好放在搖床上搖洗，會減少背景，親測管用。再有一點就是畫阻水圈，不要畫太粗太細，更不要畫地太靠近組織，否則滴加的極性試劑遇到油性阻水圈形成的液面會變高，導致組織邊緣接觸不到試劑而變干，從而有很高的背景。

    IHC整個過程除了洗，我們加的試劑有SP6000（vector）、5%NGS（goat）、Avidin、Biotin、一抗、二抗、A+B complex、DAB。下面說一下試劑的作用原理。SP6000是Vector公司出的試劑，用于封閉內源性的過氧化氫酶。由于二抗后面偶聯的HRP就是一種過氧化氫酶，如果內源性過氧化氫酶太多，會造成非特異性著色。5%NGS是為了封閉內源蛋白，因為二抗對于一抗的識別是由于Fc片段，如果其他蛋白也有Fc片段同樣會被識別，從而造成非特異性著色。在這里應該想到做western blot時用5%脫脂乳粉封閉，原因之一是為了將NC膜或PVDF膜上的未能結合蛋白的孔隙封閉住，防止二抗結合到孔內造成背景色，原因之二就是封閉其他的可能會與一抗結和的雜蛋白。血清的來源只要與一抗的來源不一樣即可，goat和bovin都可以，因為一抗來源常見的無非是mouse或rabbit，選擇一個通用的更便于實驗。我們實驗室做肝癌，肝臟細胞中有大量的內源性生物素（Biotin），由于二抗之后需要avidin-biotin-HRP的信號放大過程，前面需要加入外源的avidin封閉內源性的biotin（Avidin-Biotin高親和）。由于Biotin是羧化酶的輔因子，Biotin會結合到酶的特殊位點上幫助酶發揮催化作用，再加入Biotin去封閉酶上的biotin的結合位點，在孵育AB complex的過程中才不會導致過量的biotin結合到酶的位點上，造成非特異性信號。WB的二抗上面直接偶聯HRP，而IHC的二抗上面通過偶聯Biotin的亞基，利用biotin和avidin的高親和力來提高HRP的量，從而放大信號。二抗上面偶聯HRP的量很少，而一抗結合二抗的數量有限。一個二抗結合一個biotin，一個biotin連接一個avidin，而一個avidin可以有四個基團連接biotin，于是達到了信號放大的目的。

    明確實驗原理不等于能做好實驗，個人認為實驗習慣非常重要，不僅要心明眼亮，更要手穩，才能重復出來高質量的實驗結果。