免疫組化實驗

實驗方法原理 免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。

實驗材料 切片

試劑、試劑盒 細胞通透液乙醇蒸餾水雙氧水Triton X-100羊血清DABXylene蘇木精染液雙蒸水中性樹膠

儀器、耗材 微波爐吹風機組化筆濕盒烤箱振蕩器染缸光學顯微鏡純木漿衛生紙計時器通風櫥

實驗步驟

一.  試劑配制 

1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )

9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加雙蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2 M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH2PO4·2H2O＋58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml雙蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O；B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O）。

2. Citrate Buffered Saline（0.01 M檸檬酸緩沖液，pH6.0）

28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O（A.Citrate acid（檸檬酸）：10.5 g 加雙蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（檸檬酸鈉）：29.41 g加雙蒸水至1000 ml）。

3. 細胞通透液

由終濃度分別為0.3%雙氧水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加熱的36 ml PBS，再接著加120 ul TritonX-100，并加熱一會兒，冷卻至臨用前加0.4 ml 30％H2O2。

4. 5％羊血清或封閉血清，用PBS稀釋。

5. 含0.03％H2O2的0.05％DAB（避光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。

6. 一抗、二抗均用PBS稀釋。

7. Xylene、梯度Ethanol（100％×2、95％、80％、70％、50％）、雙蒸水、中性樹膠（封裱劑）。

8. 蘇木精染液

二.  操作步驟

1.  脫蠟、水化 

（1）60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes；

（2）100% absolute ethanol：2 ×5 minutes；

（3）95% ethanol 2 minutes； 

（4）80% ethanol 2 minutes；

（5）70% ethanol 2 minutes；

（6） distilled water：5 min；

（7）PBS洗3次×3 min。

2、細胞通透、封閉內源性過氧化物酶

（1）用封閉通透液浸潤切片30 min（RT避光）。配法是用預熱40 ml PBS加120 ul TritonX-100加熱幾分鐘后，臨用前加400 ul 30％H2O2。

（2） PBS溶液洗3次×3 min。

3、抗原修復暴露抗原決定族

（1） 切片放入0.01 M檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火4 min至沸騰后，再加熱約6 min×4次，每次間隔補足液體，防止干片。

4、封閉非特異性蛋白 

（1） PBS溶液洗3次×3 min；

（2）將切片取出，周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈,在圓圈內組織滴入5%羊血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中,室溫30（10～30）min；

5、一抗孵育 

（1） 甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗（1：250、500、1000）后，放入濕盒中室溫1小時，然后4度過夜，從冰箱中取出需37 ℃復溫45 min。

6、二抗孵育  

（1）將一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；

（2） 用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入37 ℃恒溫烤箱中30 min（回收）。

（3）用PBS洗5次×5 min；

7、SP反應

（1） 加入SP后放入37度烤箱中30 min。

（2） 用PBS洗5次×5 min； 

8、顯色

（1）加入DAB（快速滴入，觀察染色情況，倒掉染液），顯色時間控制在約5 min（3～10 min），由鏡下觀察顏色控制時間。

0.05％DAB（避光）（1：20儲備液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB儲備液的配制：50 mg DAB+5 ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保存。 

9、復染、脫水、透明、封片

（1）用PBS 3次×3min后，用雙蒸水洗5 min；

（2）加一大滴蘇木素染液，胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染20 s后自來水沖洗，雙蒸水洗5 min，再用PBS返藍5 min。

（3）脫水

（4）透明

Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min

（5） 封片

中性樹膠。

收起 

注意事項

1. 蘇木素復染時間需要摸索，尤其陽性染色也在細胞核上。

2. DAB顯色時間需要達到最優化，鏡下觀察達到陽性染色明顯但背景不太深。

3. 抗體孵育時間和抗體濃度需要摸索。尤其一抗孵育最好在4度過夜。

4. 切片脫蠟和水化要充分；加反應液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但又防止干片；用組化筆畫圈時盡量畫大一點，否則墨水排斥液體，引起片周邊干片。

5. 片子著色不均勻的原因如下：

（1） 脫蠟不充分。可以60 ℃烤20 min，立即放入新鮮的xylene1；

（2）水化不全。應經常配制新鮮的梯度乙醇；

（3）抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑；

（4） 抗體孵育時，切片放傾斜；

（5）抗體孵育后PBS沖洗不充分。

（6） 制片厚薄不均勻等問題。染片盒不平，切片傾斜。

6. 一抗從4 ℃拿出后，為什么有人說要37度復溫，目的是什么？

（1） 一方面，防止切片從4 ℃直接放入PBS易脫片；

（2）另一方面，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4 ℃和37 ℃度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小于后者,后者結合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

7. 切片染色后背景太深，不易區分特異性與非特異性著色？

（1） 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制；

（2） 一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；

（3）內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

（4）非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；

（5） DAB顯色時間過長或濃度過高；

（6） PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色；

（7） 標本染色過程中出現干片，易增強非特異性著色