免疫組化操作

 （一）、儀器設備
1. 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐.
2. 水浴鍋

（二）、試 劑
1. PBS緩沖液（pH7.2―7.4）
2．0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,pH6.0,1000ml）
3. 3%甲醇―H₂O₂溶液：用30%H₂O₂和80%甲醇溶液配制
4. 風裱劑：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS（PBS）配制
5．TBS/PBS pH9.0–9.5,適用于熒光纖維鏡標本;pH7.0-7.4適合光學纖維標本
（三）、操作流程
1、脫蠟和水化：脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。
a 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘
b 無水乙醇中浸泡五分鐘
c 95%乙醇中浸泡五分鐘
d 75%乙醇中浸泡五分鐘
2、抗原修復：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：

                         抗 原 修 復（免疫組化石蠟切片）
        用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復
    福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來組織的抗原結構，蛋白多肽發生交聯，導致部分抗原表位封閉，結合位點減少，所以需要抗原修復，以暴露原來的抗原表位，達到充分顯露抗原，以不出現明顯脫片現象為佳。
                抗原修復的幾種常用方法（供參考）
    1. 微波爐加熱：在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復1-2次。根據玻片情況可參考采用微波加熱“3-5-3法”3分鐘溫火沸騰后靜止5分鐘，再溫火沸騰3分鐘即可。
適用的抗原：來源于人、大鼠、小鼠的組織標本；來源于其他動物種屬的組織標本：
    2. 沸熱修復： 電爐或水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。
    3. 高壓熱修復：在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。（骨及軟骨組織的標本選擇較溫和的微波加熱修復）
    4. 酶消化方法：
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱37℃，消化時間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原：
包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等

               石蠟切片免疫組化染色步驟
                1.三步法（以SP試劑盒為例）
●石蠟切片脫蠟至水。
●蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如果采用抗原修復，可在此步后進行。
●3%H2O2室溫孵育5~10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘×3次。
●5~10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。
●PBS沖洗，2分鐘×3次。
●滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘。
●PBS沖洗，2分鐘×3次。
●滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘。
●PBS沖洗，2分鐘×3次。
●顯色劑顯色（DAB或AEC）。
●自來水充分沖洗，復染，脫水透明、封片。
●如果必要，可選用avdin封閉內源性生物素。
                2.SABC法
（1） 脫蠟、水化
（2）PBS洗2次各5分鐘
（3）用蒸餾水或PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次
（4）抗原修復
（5） PBS洗5分鐘
（6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體
（7）滴加Ι抗50ul,室溫靜置1小時或4℃過夜或37℃1小時
（8）PBS洗3次各2分鐘
（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘
（10）PBS洗3次各2分鐘
（11）滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘
（12） PBS洗4次各5分鐘
（13） DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色
（14）脫水、透明、封片、鏡檢。

冰凍切片的免疫組化染色步驟
●速凍組織
●冰凍切片4~8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內，或進行短暫預固定后儲存于-20℃冰箱。
●室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘。也可根據需要選擇其他的固定方式。
●PBS沖洗，5分鐘×3次。
●用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。
●PBS沖洗，5分鐘×3次。
●下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）