免疫膠體金技術1

（一） 原理

免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸（HAuCl₄）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。

膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。

（二） 膠體金的制備

根據不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來制備膠體金顆粒的方法如下。

1．枸櫞酸三鈉還原法

（1）10nm膠體金粒的制備：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入 1％枸櫞酸三鈉水溶液3ml，加熱煮沸30min，冷卻至4℃，溶液呈紅色。

（2）15nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入 1％枸櫞酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15min～30min，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/L K₂CO₃0.5ml，混勻即可。

（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加熱煮沸。根據需要迅速加入1％枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，繼續煮沸約5min，出現橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、18～20nm、30nm和50nm。

2．鞣酸—枸櫞酸鈉還原法

A液：1％HAuCl₄水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。

B液：1％枸櫞酸三鈉4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K₂CO₃液 0.2ml，混合，加入雙餾水至20ml。

將A液、B液分別加熱至60℃，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍，繼續加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為5nm。如需要制備其它直徑的金顆粒，則按表15-1所列的數字調整鞣酸及K₂CO₃的用量。

表15-1鞣酸—枸櫞酸鈉還原法試劑配制表

3．制備高質量膠體金的注意事項

（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結合和活化后金顆粒的穩定性，不能獲得預期大小的金顆粒。

（2）試劑配制必須保持嚴格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經超濾或微孔濾膜（0.45μm）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質。