直接法測抗原
⑴基本原理
將熒光素標記在相應的抗體上,直接與相應抗原反應。其優點是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低;而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
⑵試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
熒光標記的抗體溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS進行稀釋
緩沖甘油:分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
搪瓷桶三只(內有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)
有蓋搪瓷盒一只(內鋪一層浸濕的紗布墊)
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
⑶實驗步驟
① 滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待檢標本片上,10min后棄去,使標本保持一定濕度。
② 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液,使其完全覆蓋標本,置于有蓋搪瓷盒內,保溫一定時間(參考:30min)。
③ 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗后,再按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不時振蕩。
④ 取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標本干燥,加一滴緩沖甘油,以蓋玻片覆蓋。
⑤ 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度,一般可用“+”表示:
(-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱,但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++ --++++)熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上,而各種對照顯示為(±)或(-),即可判定為陽性。
⑷注意事項
1)對熒光標記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋度不應超過1:20,抗體濃度過低,會導致產生的熒光過弱,影響結果的觀察。
2)染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化,染色時間可以從10 min到數小時,一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于37℃可加強染色效果,但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2℃的低溫,延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。
3)為了保證熒光染色的正確性,首次試驗時需設置下述對照,以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
① 標本自發熒光對照:標本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。
② 特異性對照(抑制試驗):標本加未標記的特異性抗體,再加熒光標記的特異性抗體。
③ 陽性對照:已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。
如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,陽性對照和待檢標本呈強熒光,則為特異性陽性染色。
4)一般標本在高壓汞燈下照射超過3min,就有熒光減弱現象,經熒光染色的標本最好在當天觀察,隨著時間的延長,熒光強度會逐漸下降。