抗原物質
固定劑
固定條件（min）
蛋白質抗原
95%～100%乙醇
室溫3～10
酶、激素
丙 酮
4℃ 30
免疫球蛋白
四氯化碳
病 毒
丙酮、四氯化碳、無水乙醇
室溫5～10或4℃ 30～60
多糖、細菌等
微火加熱，甲醇、10%甲醛、丙酮
室溫5～10或4℃ 30～60
類 脂 （異嗜性抗原）
10%甲醛，10%佛茂爾（ForMol）
室溫3～10
（三）水洗
固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡沖洗，最后以蒸餾水沖洗，防止自發性熒光。
（四）染色
染色分直接染色法與間接染色法。
1． 材料與試劑
（1）熒光抗體，稀釋至應用濃度。
（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液
（3）9份優質甘油加1份pH7.4PBS液即為甘油緩沖液。甘油有減少非特異性熒光的作用。
（4）帶蓋方盤
2．直接染色法
（1）將固定好的玻片置于濕盤中，滴加熒光抗體染色液，以覆蓋為度，加蓋，37℃感做30 min～45min。
（2）PBS沖洗3次，每次沖洗3min，即3×3ˊ沖洗。
（3）蒸餾水沖洗。
（4）滴甘油緩沖液一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
2． 間接染色法
（1） 檢查抗原：①取固定標本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ沖洗；③再加熒光標記的抗抗體，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ沖洗；⑤H2O沖洗，涼干；⑥加甘油緩沖液，封片、鏡檢。
（2） 檢查抗體：①以免疫后動物的淋巴組織涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相應抗原液（按1﹕100～1﹕500稀釋），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ沖洗；④加熒光抗體，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ沖洗；⑥水洗，涼干；⑦加甘油緩沖液，封片、鏡檢。
（五）結果顯示
熒光顯微鏡所觀察到的圖象，主要以兩個指標判斷結果，一個是形態學特征；另一個是熒光的亮度，在結果的判定中，必須將二者結合起來，綜合判定。
熒光強度的表示方法如下：
＋＋＋ ～ ＋＋＋＋：熒光閃亮，呈明顯的亮綠色。
＋＋ ：熒光明亮，呈黃綠色。
＋ ：熒光較弱，但清楚可見。
± ：極弱的可疑熒光。
－ ：無熒光。
（六）標本保存
由于熒光色素和蛋白質分子的穩定性都是相對的，因此隨著保存時間的延長，在各種條件影響下，標記蛋白可能變性解離，失去其應有的亮度和特異性。因此給標本的保存帶來一定的困難，所以在標本進行熒光染色之后應立即觀察。
保存的方法可采取以下幾種：①固定標本片以后低溫保存，隨用隨染；②染色片采取優質封